Способ проведения иммуноанализа Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

1

Изобретение относится к методам проведения иммуноанализа и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, промышпенности для определения биологически активных соединений.

Цель изобретения - увеличение чувствительности способа -за счет использования метадлопорфиринов в качестве маркеров,

На фиг. 1 приведен спектр поглощения Pd-копропорфирина I в водном растворе (максимумы поглощения 396,514 и 548 нм); на фиг. 2 - кор- ректированньй спектр испускания Pd- копропорфирина 1; на фиг. 3 - зависимость интенсивности люминесценции от концентрации: 1)Р6-копропорфирин I (возбуждение при 395 нм, регистрация при 665 нм); 2) европий (возбуж- при 337 нм, регистрация при 616 нм); на фиг. 4 - калибровочная кривая для определения моноклональ- ных антител твердофазным методом (концентрация меченных антител на второй стадии 30 н.моль/л).

Пример 1. Получение Pd(2+)- копропорфирина I. К раствору 72,7 кг копропорфирина I дигидрохлорида в 40 мл ледяной уксусной кислоты до- . бавляют приготовленный раствор 75 мг PdCl в 15 мл свежеочищенного диме- тилформалина и нагревают смесь в течение 1 ч при 120°С (спектрофотомет- рический контроль при длине волны 620 нм до паяного исчезновения полос поглощения безметального порфирина в растворе диметилформамида). К го VI ч

Р

|рячему раствору добавляют 1,5 мл во- |ды и постепенно охпалОдают до комнатной теютературы. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, про- мьтают 10 мл уксусной кислоты, затем водой и этанолом и высушивают в вакуумном эксикаторе. Выход Pd(2+)- |копропорфкрина I 65 мг (85,7%). Спектры поглощения и фосфоресценции приведены на фиг. 1 и 2. Вре:ия жизни фосфоренсценции в обескислороженном водном растворе при 0,67 мс. Квантовый выход фосфоресценции 0,20. П р и м е р 2. Получение антител, маркированных Pd(2+)-кoпpoпopфиpинoм I, К 1 мг Pd(2+)-кoпpoпopфиpинa I в 1 МП воды добавляют 1,5 мг 1-цикло- . гексш1-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимидамето-п-толуолсульфоната и инкуби руют 15 мин, поддерживая рН 5,8-6,2. Полученный раствор добавляют к 20 мг моноклональных антител, растворенных в 2 мл 0,1 М карбонатного буфера,

IрН 9,0, и инкубирукуг 3 ч в темноте. Полученный раствор хроматографируют на колонке с носителем Тоуореаг 1 HW- 55, собирая фракции белкового пика. Содержание Pd(2+)-кoпpoпopфиpинa в меченном белке определяют по поглощению при длинах волн 280 и 390 нм. Чувствительность детекц1-5И на импульI сном люьмнесцет ном спектрометре LS-5 (Perkin Elmer) с временньш-разрешением антител, меченных Pd-копропор- фирином I (состав 1;3), не уступает чувствительности европневой метки, в определении на этом же приборе, и составляет 0,01 нМоль/л (фиг.З).

Примерз. Проведение твердофазного иммуноанализа. На. поверхность полистирольных пробирок адсорбируют антитела кролика против глобулинов из 1 МП 0,1 М карбонатного буфера в концентрации 10 мкг/мп в течение 3 ч при комнатной температуре. Затем раствор выливают и промьгоают пробирки 3 раза фосфатно-солевым бу

14640894

фером с Тритоном Х-100 (К-фосфат

0,01 М, рН 7,4, NaCl 0,15 М, 0,05%-ноГо Тритона X 100; ФСБТ).

В пробирки с адсорбированными антителами наливают по 1 мл стандартных растворов моноклональных антител в ФСБТ и инкубируют i ч при . После этого растворы вьшивают, промыва10 ют пробирки 2 раза ФСБТ, заливают в них по 1 МП ФСБТ, содержащего 10 мкг моноклональных антител, меченных Pd-копропорфирином I, и инкубируют 1 ч при в темноте.

15Затем растворы сливают, промывают пробирки 3 раза ФСБТ, заливают в них по 1 МП десорбирующего раствора (0,1 М NsiOH). Через 20 мин добавляют 0,1 мл 1 М раствора бисульфита нат20 рия и измеряют интенсивность фосфоресценции.

П р и м е р 4. Регистрация фосфоресценции. Возбуждение проводят азотным лазером (337 нм) с частотой 50 Гц

25 и полушириной вспьшки 10 не. На ре- гистрации используют фильтры, отсека- ницие кванты с длинами волн менее 620 нм. Время задержки 0,3 мс, счет 0,7 мс, время счета 1 с. Калибровоч30 ная кривая приведена на фиг. 4. Чувствительность анализа 0,01 нмоль/л.

35

Формула изобретения

Способ проведения иммуноанализа путем получения антител или антиге- . нов, меченных люминесцирующими соединениями, проведения иммунохимичес- кой.реакции с последующей детекцией специфического связывания по интенсивности люминесценции, о т л и ч а- ю щ и и с.я тем, что, с целью увеличения чувствительности способа, в качестве люминесцирующего соединения 45 используют фосфоресцирующие металло- порфирины, а детекцию специфического связьтания-ведут по интенсивности фосфоресценции.

40

Формула изобретения

Способ проведения иммуноанализа путем получения антител или антиге- . нов, меченных люминесцирующими соединениями, проведения иммунохимичес- кой.реакции с последующей детекцией специфического связывания по интенсивности люминесценции, о т л и ч а- ю щ и и с.я тем, что, с целью увеличения чувствительности способа, в качестве люминесцирующего соединения используют фосфоресцирующие металло- порфирины, а детекцию специфического связьтания-ведут по интенсивности фосфоресценции.

Изобретение относится к методам проведения иммуноанализа и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, промьшшенности для определения биологически активных соединений. Целью изобретения является увеличение чувствительности иммуноанализа. В качестве метки при проведении иммуноанализа использованы соединения класса металлопор- фиринов, которые способны интенсивно фосфоресцировать. Проведение иммуноанализа включает получение реагентов, ковалентно маркированных метал- лопорфиринами, проведение иммунологических реакций, в том числе с участием меченных соединений, и детекцию специфического связывания по фосфоресценции метки. Детекция проводится с микросекундным временным разрешением в растворе при комнатной температуре или в жидком азоте. Чувствительность способа составляет 0,05 н.моль/л. 4 ил. i (Л

1,0 0,8 0,6 0. 0.2.

600

650

700

-Г

9

800 (ffff)

850

К

.0 У.5

3.0

г.5

to s 1.Q

0.5

LOfffl)

-11

-7/

-11

-Ю

-9-8

LQGlCjJ l

Фиг.

в- / o-f

-W

-9 L06(C)M

-8

Фиг.З

т -7

- 2

7