Способ получения биологически активных мукополисахаридов Советский патент 1990 года по МПК C08B37/10 A61K38/01 

Изобретение относится к способу получения мукополисахаридов (МПС), обладающих антитромболитической активностью, и может быть использовано в медицине для предупреждения и лечения тромбозов и старения тканей, а также в лабораторных исследованиях.

Целью изобретения является варьирование терапевтического профиля биологически активных мукополисахаридов.

Пример 1. 500 г годного для инъекции гепарина в виде соли натрия, растворяют в 4500 мл деминерализованной воды при 18 С. Соотношение титров используемого гепарина близко 1, эти титры имеют значение порядка 160-170.

Полученный раствор энергично перемешивают, а его величину рН снижают до 2,5 путем добавления концентрированной хлористо-водородной кислоты. Затем добавляют 15 г нитрита натрия, растворенного в 300 г воды. Величину рН регулируют до 2,5 путем добавления хлористо-водородной кислоты, и общий объем доводится до 5000 мл. Дают реакции проходить в течение 45 мин, затем проверяют отсутствие остаточных азотистых ионов в реакционном растворе с помощью индикаторной бумаги, пропитанной йодистым калием с крахмалом (появление сине-фиолетовой окраски в присутствии ионов N02).

Продолжают реакцию до полного исчезновения нитрита и до отсутствия

сд г

о

0

Ј

см

реакции на йодкрахмальнзда 6умагу9 проводят проверки через каждые 3- 4 мин.

Когда эти проверки станут отрицательными, реакцию считают законченной. Затем устанавливают величину рН до .10 путем добавления концентрированного едкого натра5 и добавляют 5 г тетрагидридбората натрия Раствор перемешивают в течение 15 ч, Не вступивший в реакцию тетрагидро- борат натрия уничтожается путем уменьшения величины рН до 3S0 с помо щью концентрированной хлористо-во- дородной кислоты. Раствор перемешивают в течение 15 мин, затем регулируют величину рИ до 7,0 посредством концентрированного едкого натра. Продукты реакции извлекают путем до- бавления 10л этанола. Объемное соотношение этанол ; реакционная смесь 2;1„ Через 48 ч отстаивания продукт сцеживают и удаляют всплывшую часть. Осадок вновь растворяют в 9 л деминерализованной воды. Добавляют 100 г хлористого натрия и повышают величину рН раствора до 3,8 с помощью концентрированной хлористоводородной кислоты. Объем доводят , точно до Юл,, добавляя деминерализованную воду, и при энергичном перемешивании добавляют 10 л этанола Оставляют отстаиваться в течение 48 ч„ Всплывшую часть сифонируют и удаляют. Осадок извлекают, Тпромыва ют этанолом, измельчают и сушат в вакууме

Получают 230 г продукта со сле- характеристиками: титр VSP- 52 Е/мг; титр Йин и Весслер (Ш) 225 Е/мг; средняя молекулярная масса- 4000-5000 дальтон$ IW/VSP 4,3.

Пример 2, Способ получения фракций, имеющих титр IW и VSP в со- отношении 4,3,

5000 г годного для инъекции гепарина растворяют в 45 л деминерализованной воды при 18еС. Действуют подобным примеру 1 образом, умножая количество реактивов на 10, т.е. добавляют 150 г азотистого натрия в 3 л воды; .доводят объем реакционной смеси до 50 л; добавляют 50 г тетрагидридбората; осаждают с помощью 100 л этанола вновь растворяют в 90 л воды добавляют 1000 г хлористого натрияj доводят окончательный

n 5

0

5

0

5

5

объем до 100 л; добавляют в конечном итоге 100 л этанола.

Таким образом получают 2230 г продуктов со следующими характеристиками: титр VSP 54 Е/мг; титр Йин и Весслер (IW) 232 Е/мг; средняя молекулярная масса 4000-5000 дальтон.

Продукты реакции извлекаются путем добавления 10 л этанола, отстаиваются в течение 48 ч, сцеживаются и всплывшая часть удаляется,

Осадок вновь растворяют в 9-л воды. Добавляют 100 г хлористого натрия и понижают величину рН раствора до 3,8 с помощью концентрированной хлористо-водородной кислоты. Объем доводится точно до 10 л с помощью деминерализованной воды и при энергичном перемешивании добавляют 10 л этанола. Оставляют отстаиваться в течение 48 ч. Всплывшую часть сифонируют и удаляют. Осадок извлекают, промывают этанолом, измельчают и сушат в вакууме.

Получают 230 г продукта со следующими характеристиками: титр VSP 52 Е/мг; титр Йин и Весслер (IW) 225 Е/мг; средняя молекулярная масса 4000-5000 дальтон,

В примере 3 приведены результаты фармакологических испытаний, проведенных с продуктом примера 1,

На фиг. 1-4 приведены кривые, полученные при изучении в лабораторных условиях изменений времени свертывания, вызванных в плазме крови человека возрастающими дозами стандартного гепарина и продукта из примера 1 .

В испытаниях, соответствующих результатам данных на фиг. 3 и 4, использовали плазму без тромбоцитов и обедненную фактором XI.

На фиг. 1 - 4 показаны изменения в секундах у тромбина (фиг. 1), кефа- лин-каолина (фиг. 2), свертывания в присутствии концентрированного тромбопластина (фиг. 3) и разбавленного тромбопластина (фиг. 4), вызванные испытуемыми продуктами, т.е. продуктом из примера 1 (кривые ал, а, аэ и а.) и гепарином кривые Ъ , Ъг, Ъ4) з зависимости от соответственно использованных доз.

Время тромбина и кефалин-каолина представляет собой типы измерения, отражающие действие исследуемых препаратов соответственно на ингибирование усиленного фактора II и общее свертывание. Кривые на фиг. 1 и 2 показьюают, что МПС в соответствии с изобретением оказывают значительно меньшее действие, чем действие гепарина, на ингибирование активации протромбина и на уровне общего свертывания. Фиг. 3 и 4, представляющие явления, более непосредственно связанные с последовательностью эн- зиматических реакций, характеристиками наружного свертывания (а именно при относительном отсутствии фак- тора Х1а), показывают эффективность МПС по изобретению по сравнению с гепарином.

Пример 4. Исследование ан- титромболитической активности продукта из примера 1 на кролике.

Назначение 500 и IW кролику вызы вает значительную активность против Ха, а общая противосвертывающая активность остается относительно незначительной. Через 2 ч после наз начения активность составляет поряд ка 0,88 Е/мл, а время кефалин-каоли1 на 0,09 Е/мл.

Испытания в стеклянной колбе и на живом организме показывают более селективную активность МПС по изобретению, а именно, на уровне инги- бирования фактора Ха по сравнению с активностью гепарина.

Сравнительные данные по антикоа- гулирующей активности мукополисаха- ридов, полученных по предлагаемому

15706516

-и известному способам, приведены в

таблице.

Анализ представленных в таблице данных свидетельствует о различном терапевтическом профиле известных соединений и полученных по изобретению.

10

Формула изобретения

Способ получения биологически активных мукополисахаридов деполимеризацией гепарина в растворе деминера-

линованной воды в присутствии депо- лимёризующего агента с выделением целевого продукта осаждением этанолом, отличающийся тем, что, с целью варьирования терапевтического профиля биологически активных мукополисахаридов, в качестве деполимеризующего агента используют нитрит натрия и деполимеризацию осуществляют при концентрации гепарина

5 мас.% и нитрита натрия - 0,0435 М при рН 2,5 до полного отсутствия ионов N0, перед выделением целевого продукта доводят рН реакционной смеси до 7 раствором едкого натра, вводят в нее этанол в объемном соотношении этанол : реакционная смесь, равном 2:1, и выделившийся осадок растворяют в водном растворе NaCl при рН 3,8, а выделение целевого продукта проводят при объемном соотношении этанола и реакционной смеси 1 :1 .

Изобретение относится к способу получения биологически активных мукополисахаридов, применяемых в медицине. Целью изобретения является варьирование терапевтического профиля мукополисахаридов. Эта цель достигается способом, заключающимся в деполимеризации гепарина под действием нитрита натрия в водном растворе при концентрации гепарина 5 мас.% и нитрита натрия - 0,0435 М, при PH 2,5 до полного отсутствия ионов NO₂, перед выделением целевого продукта доводят PH до 7, вводят этанол и выделившийся осадок растворяют в водном растворе хлористого натрия при PH 3, 8, а выделение целевого продукта проводят при объемном соотношении этанола и реакционной смеси 1:1. 4 ил., 1 табл.

160 225 232 1500

160 52 54 60

IT

re« to Фая.ъ

a

so

US В/мл

Редактор А. Шандор

Составитель Т. Мартинская

Техред,Л.Сердюкова Корректор М. Кучерявая

Заказ 1461

Тираж 446

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

.

0.1

0.2 аз

Фиг. fy

fa Чяе/нн

Подписное