Способ получения вещества 41 200 @ ,обладающего иммуностимулирующим действием Советский патент 1983 года по МПК A61K39/00 C12P1/04 C12R1/265 

Изобретение относится к микробио логии и иммунологии, и касается спо соба получения вещества, обладающего Иммуностимулирующим действием. Известен способ получения водора воримого вещества микробактериальной природы, обладающего иммуностим лирующей активностью pi. Однако известный способ обеспечивает получение иммуностимулятора из микробактерий. Целью изобретения является получение вещества 41 200 R Р, обладающего иммуностимулирующим действием. Цель достигается тем, что соглас но способу получения вещества, обладающего иммуностимулирующим действием, водную суспензию клеток Mic rococcus sedogenes штамма М 78 (NRR В-3505) обрабатывают лизоцимом из ра чета 2-20 мг/г сухих клеток при рН 6,5-8,0 в течение 1-3 ч и темпера туре , из полученной жидкой фазы выделяют целевой продукт в виде соли, обрабатывают его водным раствором хлористого кальция при конечной концентрации его в растворе 5-50 г/л, затем отделяют целевой продукт, растворяют его в воде до концентрации 10-50 г/л, добавляют равный фенола и выделяют целевой продукт с молекулярной массой методом фракционирования на молекулярном сите. Используемый для осуществления способа продуцент Micrococcus sedogenes штамм М 78 выделен из образ-, ца почвы, взятой в Бразилии. Штамм депонирован в Лаборатории северных региональных исследований в США. Депортамент сельского хозяйства под номером , В-3505. Штамм М 75 Micrococcus sedogenes характеризуется следующими свойствами. Культурально-морфологические признаки. При выращивании в статических условиях в течение 2k ч при 2бс образует кокковидные граммположительные клетки, не резистентные к кислотам, иммобильные, диаметром 1-1,3 микрона, отдельные или сгруппированные по 2 или клетки, или в виде цепочек клеток, или в виде беспорядочных скоплений по 20-50 кле ток. Наличие спор не наблюдалось. На скошенном питательном агарагаре образует жирный обильный нaлet ровный или слабо.бугорчатый, без запаха, не окрашенный, мягкой коней- i стёнции. На литательном агар-агаре в чашках Петри образует круглые колонии с ровными краями и гладкой поверх- .., ностью, колонии сплющены или слегка выпуклые, непрозрачные. В питательном глюкозусодержащем бульоне дает помутнение среды, без запаха, без пигмента, образует хлопьевидный осадок. На картофеле образует жирный налет , гладкий, бледно-желтого цвета, без почернения картофеля; растворимый пигмент не образует. Физиолого-биохимические свойства. Строгий аэроб. Оптимальная температура роста: С - неразвивается, 22 С - хорошее развитие, очень хорошее развитие (opt), 30 С хорошее, развитие, З7с - посредственное развитие, S°C - не развивается. Нитраты в нитриты восстанавливает. Хромогенез отрицательный. Индол и сероводород не образует. Желатин не разжижает в течение 21 дня. Казеин гидролизует. Тест на метил рот отрицательный. Реакция Voges Proskauer отрицательная. Молоко не коагулирует, не пептонизирует; подщелачивание до рН 6,17,5 между первым и двадцать первым днем. Реакция на каталазу положительная, реакция на оксидазу отрицательная.: Не сбраживает до кислоты глюкозу, галактозу, арабинозу, сахарозу, лактозу, маннитол, глицеррл. Крахмал гидролизует. Эскулиновая среда - без почернения. На среде с k% NaCI развитие среднее, с 0% NaCl - не развивается. . Мочевину в качестве единственного источника азота не усваивает. Уреаза - отрицательно. Хитин не гидролизует. На автотрофной среде с (NN4)2504 в качестве единственного источника азота не развивается, нитриты из NH не образует. В качестве источника углерода усваивает крахмал, этанол, ацетат натри1я, пропионат натрия, янтарную кислоту, яблочную кислоту, цитрат натрия, пируват натрия. Слабо усваивает или совсем не усваивает рибозу, арабинозу, глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, инозитол, трегалозу, глицерол, манитол, глутаровую кислоту, тертрат натрия, галактуроновую кислоту.

Используя цитрат натрия в качестве источника углерода и заменяя основной среды различными азотсодержащими соединениями, устаио лено f что штамм хорошо усваивает NaNOj, NaNOg , NH. , Оо -аспарагин сукцинимид, глицин, Ооб-аланин, Dot -аспарагиновую кислоту, 0(з.-/+/-глутаминовую кислоту,L-/-/-тирозин, boi-пролин. Не усваивает аденин, урацил, креатинин, 0-/+|-глюкозамин, саркозин, oiL - /-t-/ -аргинин, Det-метионин бетаин.

Способ получения вещества 200 R Р.осуществляется следующим образом

Культивирование может быть осуществлено всеми методами аэробного культивирования - поверхностным или глубинным. .

Ферментационная среда может содержать в качестве источника углерода декстрин, крахмал, спирты, молочную , лимонную кислоты, и другие углеродсодержащие вещества. Можно использовать некоторые растительные или животные масла, TaKijie как свиное сало или соевое масло.

В качестве источника азота можно использовать неорганические или органические соли аммония, некоторые аминокислоты. Они могут быть внесены с различными комплексными веществами, такими как кйзеин, лактальбумин,глутен и их гидролизаты, соевая мука, арахисовая мука, рыбная мука, экстракты из мяса, дрожжей, растворимые остатки от дистилляции зернового спирта, жидкость после замачивания кукурузы.

Сера И фосфор обычно вносятся в достаточном количестве с различными вышеперечисленными комплексными веществами. Они могут также быть . внесены в виде сульфатов и фосфатов.

, Из минеральных соедине ний можно использовать фосфаты щелочных или щелочно-земельных металлов или карбонаты кальция или магния, хлориды и сульфаты, щелочных или щелочно-зе,мельных металлов или соли цинка, кобальта, железа, меди, марганца.

рН исходной ферментационной среды 6,0-7,8, предпочтительно 6,5-7,5. Оптимальная температура ферментации ч

25-30 0, но удовлетворительное производство достигается при 20-35 С. Аэрация ферментации может изменяться в довольно широких пределах. Аэрация 0,3-3 л воздуха на 1 л среды в

5 минуту наиболее оптимальна. Максимальный выход получают через 8-20 ч, культивирования, предпочтительно через 15.ч, причем время ферментации зависит главным образом от использу0емой среды. рН - ферментационной среды в конце культивирования обычно составляет 7,,8, предпочтительно 8,0-8,4.

Биомассу отделяют от фермента5ционной среды путем фильтрации или центрифугирования, предварительно подкисляя культуральную жидкость до рН 3,0 с помощью соляной кислоты.

В дальнейшем можно использовать

0 либо неочищенные бактериальные клетки, либо осуществить дегидратацию лиофилизацией или промывку спиртом или ацетоном, затем высушить при

5 пониженном давлении, получая очищенные высушенные клетки. Перед их последующим использованием предпочтительно полученную биомассу прогревают при 120-130°С в течение 3060 мин.

0

Пример 1.8 ферментер емкостью 170 л загружают пептон 1200 г, мясной экстраку 600 г, соевое масло 1200 см, водопроводную воду до 110 л. Устанавливают рИ 6,9

5 добавлением 10 н. раствора NaOH, за- тем среду стерилизуют путем барботажа пара при 122 С в течение tO мин. Далее среду охлаждают для конденсации па.ра, получая объем среды 120 л,

0 рН среды 6,7. Засевают 200 см культуры Micrococcus sedogenes штамм М 78.

Культивирование проводят при 27°С в течение Tt ч при перемешивании и аэрации стерильным воздухом. Полу5чают посевной материал.

Ферментацию проводят в ферментере емкостью 800 л в питательной среде, содержащей, кг: L. -молочная кислота ; соевое масло 2; сульфат аммо0ния 2,; хлористый натрий 2; первичный фосфат калия Q,, сульфат ма1- ния 7Н20 0,8, сульфат меди 5Н20 . 0,02, сульфат цинка 7Н20 0,012, хлористый кобальт 6Н20 0,008. Кроме

5 того, питательная среда содержит до 370 л водопроводной воды. -рН среды доводят до 7,1, добавляя 2950 см 10 н. раствора едкого натра. Затем среду стерилизуют барботированием пара при в течение «О мин,После охлаждения объем бульона составляет 400 л, рН ,2 доводят до 6,6 добавлением 2100 см водного 5 н. раствора NaOH. Среду засевают л посевного материала. Ферментацию ведут при 27С в течение 1б ч при перемешивании со скоростью 205 об/мин и при аэрации стерильным воздухом со скоростью 15 ., По окончании процесса ферментаци рН 8,2 объем культуральной жидкости л. Культуральную жидкость охлаждают до С, рН доводят до 3,0 добавлением А л 5 н. соляной кислоты. Биомассу отделяют центрифугированием при 2900 . Клетки извлекают 80 л этанола с температурой (-10°С) при перемешивании в течение 15 мин, затем центрифугируют и высушивают при при пониженном давлении {5 мм рт.ст.) в течение 15 ч. Полу чают 1500 г сухих клеток. 1 кг сухих клеток суспендируют в lO л стерильной дистиллированной воды в реакторе из нержавеющей стали, снабженном двойной рубашкой. Ус танавливают рН 7,0 10 н. растЕвором (едкого натра. Затем добавляют 2 г лизоцима и перемешивают в течение 2 ч при 37°С, периодически доводя рН до 7,0 5 н. раствором едкого нат Смесь центрифугируют на машине Sharpies М 16/2 со скоростью 17000 об/мин с дебитом 30 л/ч. Верх ний слой (37 л) ультрафильтруют (ап парат UFP 20, снабженный акриловой мембраной IRIS ), рециркулируя задержанную часть и добавляя 3 раза по 0 л деминерализованной воды, охлажденной до 4°С. Собирают 7 л удержанного вещества, концентрированного с мол. вес выше 25000 дальтон рН доводят до 7,0 5 н. раствором NaOH и лиофилизируют. Получают г сырого проду та. 31 г сырого .продукта растворяют в 1550 см деминерализированной воды при температуре около 20 С, пе мешивая в течение 30 мин, затем добавляют в течение 5 мин при постоян ном перемешивании 31 см водного ра створа 668 г/л: CaCl22H20 и перемешивают в течение 3 мин. Образова шийся осадок удаляют центрифугирова нием на лабораторией центрифуге Sharpies со скоростью АОООО об/мин с дебитом 5 л/ч. Верхний слой диализуют на целлюлозной мембране, в течение трех, дней, при k°C по отношению к л деминерализованной воды. Удержанное вещество затем обрабатывают в колбе с помощью ЗЮ см полистиролсульфоновой смолы DOWex 502 в натриевом цикле, перемешивая в течение 1 ч; смолу отфильтровывают и промывают на фильтре 310 см воды. Промывные воды объединяют с фильтратом и лиофилизируют. Получают 17 г 32919 R Р в солевой форме, характеристики которой следующие: внешний вид: порошок белого цвета; состав: 15,7 воды (по Фишеру) i на сУхой весД: протеин (сумма аминокислот) 2,6; полисахариды 3,9, нуклеиновые кислоты 28,9 (по спектру УФ). Элементный состав,: С ,30; Н.5, О (по разности) 30,71; N 0,ОЦ; р 3,11; S ниже 0,3; Na 3,7Р; Са 0,30. 25 г полученного вещества 32919 R Р растворяют в 1 л деминерализованной воды, содержащейся в реакторе емкостью 2 л, снабженном мешалкой и устройством для регулирования температуры; добавляют 1 л смеси фенола с водой (109 см воды на 1 кг фенола). Смесь нагревают до 65 С при интенсивном перемешивании. Перемешивание продолжают в течение 30 мин при этой температуре. После быстрого охлаждения реактора с помощью ледяной бани до температуры, близкой к 25 .С, разделяют фазы центрифугированием при 33005 в течение 30 мин на лабораторной центрифуге с охлаждением (JOUAN тип К 63 F емкостью л. Получают 50 см водной фазы. Фенольную фазу и промежуточную фа-зу снова экстрагируют 1 л деминерализованной воды в течение 30 мин при 65 С. После охлаждения и центрифугирования, как указано выше, снова получают см водной фазы. Водные фазы объединяют. Фенол удаляют двумя последовательными промывками с помощью 2 л хлороформа каждый раз. Водные фазы затем осветляют центрифугированием в течение 30. мин при ЗЗООЗ. Получают l800cM водной фазы. Осветленную водную фазу диализуют в течение трех дней при по отношению к л деминерализованной воды. Удержанное вещество лиофилиэируют. Получают ,5 г аморфного порошка белого цвета.

8 г этого порошка растворяют в f 00См 0,1 М стерильного буфера из ацетата натрия с |эН 7 (растворяют 136,09 г ацетата натрия для анализа в 0,9 л деминерализованной воды, затем доводят рН до добавлением уксусной кислоты, ,0t9)и доливают до 1 л. Стерилизацию осуществляют нагреванием в течение М5 мин при 122 С. Этот раствор разбавляют до 1/10 стерильной деминерализованной водой ех temppre.

Полученный раствор выливают в колонку с sepharose С1 (диаметр 13,5 см, высота 65 см), помещенную в холодную камеру () , забуференную 0,1 М стерильным буферным раствором ацетата натрия, рН 7,0. ЭлюироЬание осуществляют с помощью того же самого буфера с дебитом 1,33 л/ч, регистрируя непрерывно абсорбцию при 230 нм при 0,1 см элюата.

Собирают сначала фракцию 3,13 А, которую удаляют. Следующую фракцию (1,22 л), которая соответствует пику абсорбции при 230 нм, вводят в т|1)убку с регенерированной целлюлозой NOJAX и диализуют при . в течение трех дней по отношению к 3 Q л деминерализованной воды, затем удержанное вещество (1300 см ) лиофилизируют. Полученное твердое вещество обрабатывают 9 см деминерализованной воды и раствор деализуют с п мощью указанной мембраны в течение 8 ч при С по отношению к 220 лдеминерализованной воды. Удержанную часть лиофилизируют.

Получают 1,3 г вещества 1 200 ffP характеристики которого следующие: внешний вид: аморфный порошок бело-го цвета.

Основные полосы ИК-абсорбции вещества 1200 R Р, выраженные в волновых числах, (о.с. - очень сильная; с - сильная; ср. - средняя;

ел. - слабая; о.ел. - очень слабая пл. - плечо):З 20 о.с. (в которой Н20)

3280 пл.

3030 пл..

2970 пл.

2950 пл:

2920 с.

28V5 ср.

2680 пл.

2100 о.ел. 1230 ср. 775 ел.

1730 пл. 1210 пл. 720 пл.

о.с. 1160 с. 630 пл.

с. .1115 с. 560 с. (в которой )

Ибо пл. .10600.ел.520 пл.

пл. 1025 пл. пл.

пл. 945 ср. пл.

1375 е. 900 ел. 00 пл.

1335 пл. 875 ел. 365 пл.

1310 ер. 800 ер.

Соетав: 3,8 (по Фишеру);на еухой вее, %: аминокислоты 12,3 (из которых 7 аланина); глюкоза 11,95; нуклеиновые кислоты менее 1,3 (по УФ-спектру); аминосахар 16,3.

Элементный анализ,%: С н 7, N 4,85; О 37; Р 1,17; С1 0,25 Na 2,36; Са 1,33; S менее 0,5; электрофорез.

.В геле с Т% агарозы е барбиталовым буфером с рН 8,6 и при напряжении 6 V/CM Ц1200 R Р мигрирует к аноду со скоростью примерно 11 мм/ч.(Продукт обнаруживается с помощью реактива Ши(1))а после периодического окиеления и с помощью soudan черного В).

П Р и М ер 2. Посевной материал получают согласно примеру 1. После культивирования в течение 16 ч еусло охлаждают до 4 С и его рН уетанавливают равным 3 путем добавления еоляной кислоты. Клетки выделяют центрифугированием ео скоростью tOOO об/мин. Клеточный кислый слой . затем нагревают в автоклаве в течение мин при 122. После охлаждения клетки промывают этанолом, затем выеушивают.

Оперируя как в примере 1 (ферментация и выделение) и иепользуя те же количеетва, получают 0,55 г вещества R Р в форме аморфного порошка белого цвета, характеристики которого следующие: состав: 6 воды (по Фишеру); на сухой вее; аминокиелоты 17,7 (из которых 7,2% аланина); глюкоза 10,5, нуклеиновые киелоты менее 3, аминоеахар 15,2.

Элементный анализД: С «6,90; Н 7,32; N 5,38; О 35; Р 1,08; С1 0,18 Na 2,26; Са 1,83; S менее 0,5.

ИК-еректр этого продукта идентичен е вещеетвом .41200 R Р, полученны в примере 1.

При введении мышам внутривенно,

подкожно, 1нтраперитонеально или инт1раназольно вещество 1200 R Р значи.тельно повышает сопротивляемость мышей, зараженных летальной дозой Listeria monocyto enes Staphylpcoccus aureus Escherichia coli и вирусами, такими как энцефаломиокардитный вирус, вирус мышиного гепатита, вирус гриппа (человеческий вирус, адаптированный на мыши, типа А и А) , вирус герпеса и арбовирус. Повышенное резистентное состояние длится в течение 9б м после обработки.

Введенный парентерально мышам это продукт сильно стимулирует фагоцитарную способность ретикулоэндотелиальной системы и повышает (в экспери менте на крысах) количество лимфоцитов, продуцирующих антитела. Испытывают стимулирующий эффект в реакции гипермувствитвльности замедленного типа и по продуцированию антител по отношению к отдельным антигенам.

У мыши, которой пересажены клетки (например, клетки саркомы 180),введение полученного вещества вызывает некротическую реакцию. В некоторых условиях вещество, полученное по данному способу, повышает количество и/или цитолитическую активность лимфоцитов Т крысы по отношению к опухолевым аллогенным клеткам.

Использование предложенного способа позволяет получить вещество 41200 R Р, обладающее иммуностимули рующим действием.

Способ получения вещества, обладающего иммуностимулирующим действием, заключающийся, в том, что водную суспензию клеток Micrococcus sedogenes штамма И 78 (NRRo6B-3505) обрабатывают лизоцимом из расчета 2-20 мг/г сухих клеток при рН 6,5 8,0 в течение 1-3 ч и температуре С,из полученной жидкой фазы выделяют целевой продукт в виде соли, обрабатывают его.водным раствором хлористого кальция при конечной концентрации его в растворе 5-50 г/л, затем отделяют целевой продукт, растворяют его в виде до концентрации 10-50 г/л, добавляют равный объем фенола и выделяют целевой продукт с молекулярной массой 510-510 методом фракционирования на молекуСО лярном сите.