1-ФЕНИЛ-3-ОКСИ-4-ЭТОКСИКАРБОНИЛ-5-П-БРОМФЕНИЛ-2,5-ДИГИДРОПИРРОЛ-2-ОН, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ ПРОТИВОВИРУСНУЮ АКТИВНОСТЬ Советский патент 1996 года по МПК C07D207/38 A61K31/40 

Предлагается новое химическое соединения пирролонового ряда, а именно 1-фенил-3-окси-4-этоксикарбонил-5-n-бромфе- нил-2,5-дигидропиррол-2-ону (I) формулы
которое проявляет противовирусную активность и может быть использовано в медицине.

Целью изобретения является поиск в ряду пирролонов новых соединений, обладающих широким спектром высокой противовирусной активности, превосходящей активность известных противовирусных препаратов.

П р и м е р. 1-Фенил-3-окси-4-этоксикарбонил-5-n-бромфенил-2,5-дигидропиррол-2-он (I).

К раствору 3,0 г (0,0159 моль) диэтилового эфира щавелевоуксусной кислоты в 5 мл этанола прибавляют смесь из 2,95 г (0,0159 моль) n-бромбензальдегида и 1,45 мл (0,0159 моль) анилина в 10 мл этанола. Реакционную смесь выдерживают при 20^оС в течение 24 ч, выпавший осадок отфильтровывают, перекристаллизовывают из толуола и получают 3,2 г (50%) целевого продукта. Т. пл. 191-193^оС.

Найдено, С 56,84; Н 3,98; Br 19,61; N 3,31.

С₁₉Н₁₆BrNO₄
Вычислено, С 56,72; Н 4,01; Br 19,83; N 3,48.

В ИК-спектре соединения I, снятом в вазелиновом масле, присутствуют полоса поглощения С=С-двойной связи при 1655 см^-1, полосы поглощения лактамного карбонила при 1680 см^-1, сложноэфирного карбонила при 1705 см^-1 и енольного гидроксида при 3312 см^-1.

В ПМР-спектре, снятом в CDCl₃, присутствуют триплет и квадруплет протонов этоксигруппы при 1,15 и 4,07 м.д. синглет протона в положении 5 гетероцикла при 5,43 м.д. и мультиплет ароматических протонов при 7,25 м.д.

Соединение I испытывали на противовирусную активность в отношении вирусов везикулярного стоматита, герпеса простого, осповакцины, венесуэльского энцефаломиелита лошадей, бешенства и клещевого энцефалита.

При проведении испытаний использовали тканевую культуру первично-трипсинизированных фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) производства отдела культур клеток БелНИИЭМ, выращенную на 5%-ном гемогидролизате, беспородных белых мышей-сосунков обоего пола, вирусы осповакцины (ВОВ), герпеса простого I типа (ВГП), везикулярного стоматита (ВВС), венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВВЭЛ), вакцинного бешенства, клещевого энцефалита (КЭ), клещей.

Культуры ФЭК, выращенные на чашках Петри и дне пенициллиновых флаконов, отмывали от ростовой среды средой 199, наносили 0,00002 БОЕ/клетка ВОВ, ВГП, ВВС и ВВЭЛ в среде 199. После часового контакта вируссодержащую жидкость удаляли и наносили покрытие на основе среды 199, включающее 1% бактоагара; 0,005 нейтрального красного, антибиотики. Для культур, выращенных на дне пенициллиновых флаконов, в состав покрытия добавляли соединение I с тем, чтобы его конечная концентрация составила 12,50 мкг/мл и менее (метод редукции бляшек). После застывания агарового покрытия на чашках Петри вырезали лунки на всю глубину слоя. В лунки устанавливали мерные (0,05 мл) отрезки стеклянной трубки, заполненные взвесью излучаемого вещества (скрининг-тест). После 48-часовой инкубации культур сосчитывали количество бляшек (при исследовании методом редукции бляшек) или измеряли диаметр концентрических зон токсичности и подавления образования бляшек (при исследовании методом скрининг-теста). Титр вируса рассчитывали, исходя из количества бляшек.

Токсические свойства соединения I для ФЭК исследовали на культурах, выращенных на боковой стенке флаконов из-под антибиотиков. Вещество разводили на среде 199 с добавлением 1% диметилсульфоксида и наносили на отмытые от ростовой среды клетки. Инкубацию вели 96 ч, после чего регистрировали цитопатическое действие изучаемого соединения при малом увеличении микроскопа. Затем в поддерживающую среду добавляли 0,1 мл 0,1%-ного водного раствора нейтрального красного на 1 ч, клетки трижды отмывали раствором Хенкса без фенолового красного, заливали на 1 ч этанолом и оценивали степень поглощения нейтрального красного клетками по оптической плотности. Последнюю измеряли на СФ-26 при 510 нм. Максимальной толерантной концентрацией (МТД) считали наивысшую дозу соединения I, не вызывающую изменений клеточной морфологии и нарушения поглощения красителя.

Критерием антивирусного действия служили наличие и величина зоны подавления образования бляшек, снижение титра вирусов в присутствии различных концентраций соединения. Минимальной активной концентрацией (МАК) считали дозу, в присутствии которой регистрировалось снижение титра вируса на величину, соответствующую не менее 1,25 lg БОЕ/мл. Химиотерапевтический индекс (ХТИ) высчитывали как отношение МТД/МАК.

В экспериментах на животных использовали дозу вируса КЭ и бешенства, соответствующую 10 LD₅₀/0,25 мл. Инфицирование проводили подкожно, суспензию вируса готовили на среде 199. Раствор соединения I на бидистиллированной воде с добавлением 25%-ного диметилсульфоксида вводили мышам подкожно в дозах 12,5 и 6,25 мкг/жи- вотное за 24 и 1 ч до заражения и еще в течение трех дней после него один раз в день (лечебно-профилактическая схема) или в течение 5 дней по одному разу в день, начиная с дня инфицирования (лечебная схема).

Наблюдение за мышами вели в течение 21 дня. Об эффективности соединения судили по увеличению выживаемости в сравнении с контрольной группой. Животным контрольной группы вводили растворитель.

Исследования на животных выполняли одновременно с известным противовирусным препаратом амантадином. Оба вещества исследовали в каждом эксперименте параллельно. Использовали водный раствор амантадина.

В экспериментах на тканевой культуре установлено, что соединение I обладает способностью подавлять размножение ВГП, ВОВ, ВВС и ВВЭЛ (см. табл.1).

При этом в отношении ВОВ он проявляет высокую активность, в отношении ВГП и ВВС среднюю. Значимое снижение титра ВВЭЛ отмечено только в присутствии соединения в концентрации, соответствующей МТД.

В опытах на животных соединение I обеспечивает высокий защитный эффект, достигающий 62,5% снижения летальности мышей и увеличения продолжительности их жизни до 5,4-10,3 дней (см. табл.2).

В экспериментах на белых мышах, зараженных вирусом КЭ, соединение I также проявило четко выраженное протективное действие. Выживаемость животных на 7 сутки составила 87,5% при 100% гибели контроля, продолжительность жизни возросла в 1,5 раза.

В крови белых мышей, получавших 1-фенол-3-окси-4-этоксикарбонил-5-n-бромфе- нил-2,5-дигидропиррол-2-он (I), подавлялось размножение вируса КЭ более чем в 100 раз. Если в контроле у животных развивалась напряженная вирусемия (4,25 lg LD₅₀/0,03 мл), то у подопытных животных титр вируса в крови был 2,0 lg DD₅₀. Известно, что при арбовирусных инфекциях, таких как КЭ, при низком уровне вирусемии преpывается диссеминация возбудителя через питающихся иксодовых клещей, которые являются переносчиками и длительными хранителями вируса КЭ. В экспериментах, где на зараженных вирусом КЭ животных, получивших соединение I, подсаживали для питания личинки иксодовых клещей, последние получали ничтожную дозу вируса, на 2,25 lg LD₅₀ меньшую, чем в контроле. Более того, под влиянием соединения I сами клещи погибали в 68,8% случаев. Следовательно, соединение I не только ингибирует вирус КЭ в организме животных, но и подавляет интенсивность циркуляции названного арбовируса между позвоночными животными и переносчиками кровососущими членистоногими.

Таким образом, соединение I обладает способностью подавлять размножение вирусов простого герпеса, осповакцины, везикулярного стоматита, венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Оно высокоэффективно ингибирует указанные вирусы, ХТИ для вируса осповакцины составляет 8, а для вирусов простого герпеса и везикулярного стоматита 4. Активность соединения I превосходит активность известного препарата амантадина в 4 раза.

Кроме того, соединение I эффективно защищает лабораторные животные от инфекции, вызванной вирусом бешенства. На 100 62,5% снижается летальность животных и увеличивается продолжительность их жизни до 5,4-10,3 дней.

Изобретение относится к гетероциклическим соединениям, в частности к 1-фенил-3-окси -4-этоксикарбонил-5-n-бромфенил - 2,5-дигидропиррол -2-ону, который проявляет противовирусную активность и может быть использован в медицине. Цель - выявление более активных соединений указанного класса. Получение ведут реакцией диэтилового эфира щавелевоуксусной кислоты со смесью n-бромбензальдегида и анилина в спирте при комнатной температуре. Выход 50%, т. пл. 191 - 193^oС. Брутто-ф-ла C_1 9 h_1 6 BrNO₄. Новое соединение подавляет размножение вирусов простого герпеса, осповакцины, везикулярного стоматита, венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Активность превосходит активность амантадина в 4 раза. Кроме того, новое соединение защищает лабораторных животных от инфекции, вызванной вирусом бешенства. Защитный эффект при лечении соединением состоит из 100 - 62,5% снижения летальности животных и увеличения продолжительности их жизни до 5,4 - 10,3 дней. 2 табл.

1-Фенил-3-окси-4- этоксикарбонил-5-п-бромфенил -2,5-дигидропиррол-2-он формулы

проявляющий противовирусную активность.