Противовирусное средство Советский патент 1993 года по МПК A61K31/52 

Изобретение относится к разделу вирусологии и может быть использовано для решения задач, связанных с ингибированием вирусных инфекций.

Поиск антивирусных средств среди официальных препаратов является сегодня особенно актуальным в связи с тем, что разработка ингибиторов вирусной активности из химических соединений остается процессом очень длительным, занимающим 10-15 лет. При этом, не исключено, данный процесс на определенной стадии может быть вообще сорван из-за возникающих технологических, технических, организационных или других сложностей.

Цель изобретения: поиск высокоэффективного антивирусного средства в отношении лекарственно устойчивых вирусных штаммов.

Цель достигается применением сердечно-сосудистого препарата трентал,

Трентал известен как средечно-сосуди- стое спазмолитическое ср едство. Оказывает сосудорасширяющее действие, способствует улучшению снабжения тканей кислородом, ингибирует фосфодиэстеразу и вызывает накопление в тканях циклического АМФ, тормозит агрегацию тромбоцитов и уменьшает вязкость крови. Применяется при нарушениях периферического кровообращения и цереброваскулярной патологии (атеросклеротических нарушениях, ишеми- ческих состояниях и др.), при сосудистой патологии глазного дна, при диабетических ангиопатиях.

Новизна изобретения заключается в обнаружении утрентала новых биологических свойств в виде антивирусного действия.

Неочёвидность изобретения состоит в том, что- нельзя было предложить наличие у широкоприменяемого в кардиологической практике препарата, обладающего лечебным эффектом при бердечно-сосудистой патологии, новой функции - ингибированйе вирусов.

00

00

ел ю ю

Неожиданность положительного эффекта заключается не только е обнаружении новой биологической активности подавлять вирусную репродукцию, но и в выявлении высокой эффективности ингибиции широко- го спектра РНК- и ДНК-содержащих вирусов с воздействием на лекарственно устойчивые вирусные .

П р и м е р 1. Изучение ингибирующей

активности препарата трентал в отношении

10

вируса простого герпеса (штамм 1C) осуществляли ин витро на трипсинизированной культуре фибробластов эмбрионов кур (ФЭК). Культуру клеток, выращенную на чашках Петри (скрининг-тест) и дне пенициллине- 15 вых флаконов (метод редукции бляшек) отмывали от ростовой среды и вносили 0,001-0,00001 ВОЕ/клетка вируса. После адсорбции при 37°С вирус удаляли и моно- слой покрывали твердым питательным по- 20 крытием, приготовленным на основе среды 199+1% агара+ 0,005% нейтрального красного. На инфицированные чашки Петри, покрытые агаровым покрытием, вносили в стеклянные трубочки (0,05 мл) препарат. По- 25 еле инкубации при 37°С определяли диаметры зон токсичности и подавления образования бляшек (мм), Используя метод редукции бляшек, препарат добавляли в различных концентрациях в состав твердо- 30 го агарового покрытия. После инкубации при 37°С в течение 48 - 72 ч определяли инфекционный титр вируса как в присутствии препарата, так и без него. Критерием антивирусной активности служило сниже- 35 ниетитра вируса в присутствии препарата в сравнении с контролем. Минимальной активной концентрацией (МАК) считали снижение титра вируса в сравнении с контролем на 1,25 Ig БО.Е/кл.

Определение токсичности для культуры ФЭК проводили путем инкубации клеток при 37°С в присутствии различных концентраций препарата в течение 96 часов. Максимально переносимой концентрацией (МПК) считали 45 наивысшую дозу, не вызывающую цитоде- структивных изменений клеток при регистрации под малым увеличением микроскопа. Химиотерапевтический индекс (ХТИ) определяли как отношение МПК/МАК. 50

В результате проведенных исследований оказалось, что трентал. являясь малотоксичным препаратом для культуры клеток (МПК-800 мкг/мл), обладал выраженным ин- гибирующим действием в отношении виру- 55 са простого герпеса (штамм 1C). Так, в дозе 100 мкг/мл он полностью подавлял репродукцию вируса в культуре (табл.1).

Изучение ингибирующей активности трентала в отношении вируса герпеса, рези-

0

5 0 5 0 5 0

5 0

5

стентного к действию ацик/ювира (штамм АЦВ) осуществлялось по той же схеме. При этом в качестве сравнительного контроля был взят официнальный препарат ацикло- вир. Полученные результаты, свидетельствовали о выраженной способности трентала подавлять репродукцию АЦвРв культуре , ФЭК, который в этих же условиях не инги- бировался ацикловиром. Применяя дозу препарата, равную 100 мкг/мл, удавалось полностью ингибировать размножение ацикловиррезистентного штамма с инфекционным титром 4,64 Ig БОЕ/мл (табл.1).

П р и м е р 2. Изучение противогерпети- ческой активности трентала в системе ин виво осуществлялось на модели экспериментального герпетического менингоэнце- фалита мышей. Мышей (вес 7-10.граммов) заражали штаммом. Коптев интраобдоми- нально в дозе 100 LDso Трентал в толерантных дозах вводили внутривенно в объеме 0,2 мл по следующей лечебной схеме: через 4 часа после инфициpqвaния, затем однократно, в течение 7 дней ежедневно. Результаты оценивали по летальности леченых животных в сравнении с группой плацебо, получаемой внутривенно 0,85% раствор NaC по аналогичной схеме.

Полученные результаты представлены в таблице 2, Как видно, трентал проявлял выраженный защитный эффект-снижение летальности в группе леченных животных составило 66,6 - 75%. При этом высокая степень антивирусной активности сочеталась с большой широтой защитного эффекта - ХТИ препа-рата превышал показатель 100. Испытанные дозы препарата были толерантными для мышей. При их внутривенном введении токсические явления не отмечались. Особого внимания заслуживает тот факт, что препарат сохранял противовирусную активность в очень низких дозах, по крайней мере, в 100 раз меньших по сравнению с фармакопейными.

При м е р 3, Изучение ингибирующей активности трентала в отношении вирусов осповакцины осуществляли по схеме, описанной в примере 1, Полученные результаты свидетельствовали о способности препарата существенно подавлять репродукцию вирусов осповакцины (ВОВ) в культуре. При этом препарат ингибировал как чувствительный к метисазону лабораторный штамм (ВОВ так. и резистентный штамм вируса (BOBfy который естественно, не подавлялся метисазоном (табл.3).

П р и м е р 4, Изучение ингибирующей активности трентала в отношении ротави- руса (штамм А) осуществляли по обычной, уже описанной в примере 1 схеме. Исследования проводили на перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки (МА-140). МПК препарата для данной культуры составила 800 мкг/мл, что соответствовало таковой . на клетках ФЭК. 8 результате проведенных 5 исследований оказалось, что трентал, используемый в концентрациях 800, 400, 200 и 100 мкг/мл, снижал инфекционный титр более, чем на 1,34 Ig БОЕ/мл, что, согласно принятой оценки антивирусного действия (7), .свиде- Ю тельствует о наличии у него противоротави- русной активности (табл.4).

П р и м е р 5. Изучение ингибирующих свойств трентала в отношении вируса иммунодефицита человека (В ИЯ-1) осуществляли 15 на культуре лимфобластоидных клеток МТ- 4. В результате проведенных исследований оказалось, что препарат, будучи малоток-. сичным для данной клеточной культуры МПК 400 мкг/мл), обладал выраженной 20 способностью подавлять накопление внутриклеточных ВИЧ-антигенов. Так, по данным иммунофлуоресцентного анализа трентал в дозах 4, 20 и 200 мкг/мл йнгиби- ровал аккумуляцию ВИЧ-антигенов в клет- 25 ках на 55; 63 и 68% соответственно, что, согласно принятой системе оценки ( ), позволяет отнести его к препаратам, обладающим анти-ВИЧ активностью. В этих же дозах трентал значительно снижал инфекционный титр вируса. Доза препарата в 200 мкг/мл оказалась достаточной для полного подавления репродукции ВИЧ с титром 4 Ig ЦД50/мл(табл.5}. При этом высокая степень антивирусной активности трентала сочеталась с большой широтой его ингибирующего действия - ХТИ препарата составил 200. .

30

35

. 5 Ю

15 20 5

0

5

Изучение трентала в вирусологическом скриннинге при использовании других тест- вирусов выявило, дополнительно к описанным примерам, его ингибирующую активность в отношении вируса везикулярного стоматита (штамм Индиана),

Таким образом, цель изобретения достигнута. Выявлено высокоэффективное антивирусное средство, подавляющее лекарственно устойчивые вирусные штаммы. Как аидно из примеров 1-5, трентал, являясь малотоксичным препаратом, существенно, а иногда полностью подавлял репродукцию вирусов в культуре (от 50% до 100%), а также обладал защитным эффектом в условиях экспериментальной инфекции ин виво (66,6 - 75,0%), что позволяет считать его (согласно общепринятой систе- ме оценки) высокоэффективным ингибитором вирусной активности. Способность же препарата существенно подавлять репродукцию ацикловир и метисазонрезистентных штаммов позволяет считать его высокоэффективным ингибитором лекарственно устойчивых вирусов.

Положительный эффект трентала в отношении целого ряда ДНК-и РНК-со- держащих вирусов, простого герпеса, оспо- вакцины, иммунодефицита человека, Ъезикулярного стоматита и ротавируса позволяет отнести его к антивирусным средствам широкого спектра действия.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Применение трентала в качестве противовирусного средства.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакотерапии инфекционных болезней. Цель изобретения - повышение эффективности в отношении лекарственно устойчивых вирусных штаммов. Для этого в организм, пораженный вирусной инфекцией, вводят трентал в качестве противовирусного средства. 5 табл.

Характеристика ингибирующего действия трентала в отношении вирусов простого герпеса (ВПГ)

1 С - лабораторный штамм ВПГ, чувствительный к действию ацикловира;

инфекционный титр 4,77 Ig БОЕ/мл. АЦВ Э ацикловиррезистентный штамм ВПГ; инфекционный титр 4,64 Ig БОЕ/мл

Таблица 1

Эффективность препарата трентал на модели экспериментального герпетического менингоэнцефалита мышей.

о) ++++ - степень активности высокая

Т-а блица S Характеристика ингибирующего действия трентала в отношении вирусов осповакцины.

ВОВЧ - чувствительный к метибазрну вирус осповакцины. ВОВР - резистентный к метисазону вирус осповакцины.

Т а б л и ц а 4 - Влияние трентала на репликацию ротавируса (штамм SA) в культуре клеток МА-140.

Таблица 2

Ингибирующее действие трентала в отношении ВИЧ-1

Данные иммунофлуоресцентного анализа с использованием человеческой поликло- нальной антисыворотки, полученной от вирусоносителей; рабочее разведение 1:4бО. Исходный титр вируса составлял 4 Ig ТЦДзо/мл.

Табли.ца 5

в