Способ определения минимальной подавляющей концентрации антибиотика Советский патент 1990 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к кли- нико-лабораторным методам исследований.

Цель изобретения - повышение точности способа, а также увеличение сроков хранения готовых планшетов.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Ферментолизат биомассы

микроорганизмов (освет- ,

ленный)1,2

Глюкоза0,3

Двузамещенный натрия фосфат0,3

Хлористый трифенил- тетразолийО,1

Альгинат натрия 0,2 Дистиллированная вода Остальное В дистиллированной воде растворяют 1,2 г ферментолизата биомассы микроорганизмов, 0,3 г глюкозы и 0,3 г натрия фосфата двузамещенного, тщательно перемешивают, доводят рН до 8,0-8,2 20% NaOH, затем кипятят- в течение 5 мин и фильтруют, через бумажный фильтр. Устанавливают рН среды 7,6 концентрированным раствоел

Nj

00

со

|

ром НС1. Стерилизуют при 121е С в течение 15 мин.

Готовую среду разливают до 30 мл в 96 стерильных мерных колб емкостью 100 мл.

Для раститровки одного антибиотика требуется 8 колб - 8 разведений. В первой колбе - максимальная концентрация антибиотика (например, для бензилпенициллина она равна 32 мкг/мл Колбу встряхивают до полного растворения и равномерного распределения антибиотика в среде. Затем половину Содержимого первой колбы переносят во вторую колбу с питательной средой - в этой колбе концентрация антибиотика в два раза меньше, чем в первой колбе (для бензилпенициллина Это 16 мкг/мл). Вторую колбу встря- хивают и снова, половину ее содержимого переносят в третью колбу, где концентрация препарата в два раза меньше, чем во второй колбе (для бензилпенициллина - 8 мкг/мл). Таким образом готовят все восемь разведений одного антибиотика, а затем готовят разведения остальных антибиотиков.

Выбранные концентрации антибиоти- ков представлены в табл. 1.

После раститровки всех антибиотиков в лунки планшета с круглым дном внося по 0,1 мл раствора каждого антибиотика в таком порядке, что первая лунка Каждого из 12-ти рядов содержит максимальную концентрацию препарата, а далее следуют двукратноубывающие концентрации антибиотиков. Например, ряд с бензилпенициллином выглядит так: первая лунка 32 мкг/мл, вторая лунка 16 мкг/мл, третья лунка 8 мкг/мл, четвертая лунка 4 мкг/мл, пятая лунка 2 мкг/мл, шестая лунка 1 мкг/мл, седьмая лунка 0,5 мкг/мл, восьмая лунка 0,25 мкг/мл.

Заполненные планшеты помещаются в холодильную камеру, где постепенно понижают температуру до -40°С. Замораживание продолжают в течение 12 ч. После этого в холодильной камере устанавливают общее давление менее 100 мм рт.ст. повышают температуру на 10°С и выдерживают планшеты 40 - 50 мин. Затем постепенно повишают температуру на 30°С, а когда планшеты нагреваются, поднимают температуру до 40°С. Планшеты выдерживают в этих условиях в течение 4 ч. За это

время содержимое лунок полностью высыхает, образуя за счет альгината натрия тонко дисперсный осадок в виде застывшей пены, прочно скрепленный с дном и стенками лунок.

Из эталонной культуры Escherichia coli ATCC 25922 в пробирке с дистиллированной водой стерильно готовят суспензию, соответствующую 5 ЕД по оптическому стандарту мутности. Ино- кулят в объеме 0,1 мл вносят в каждую лунку приготовленной системы с помощью пипеточного дозатора. Планшеты помещают в термостат и инкубируют при 37°С в течение 18 ч.

Оценку результатов исследования проводят визуально по изменению окраски от темно-вишневого до образования прозрачной среды без окрашивания.

Концентрация антибиотика в последней лунке с -задержкой роста в ряду разведений антибиотика - прозрачная среда, без темно-вишневого окрашивания, соответствует значению минимальной подавляющей концентрации (МПК) данного антибиотика в отношении использованного эталонного штамма Е. coli ATCC 25922. Установлено полное совпадение результатов по уровням МПК для всех 12 антибиотиков.

Пример 2, Питательную среду готовят в соответствии с примером 1 по следующей прописи, мас.%: Ферментолизат биомассы микроорганизмов (осветленный)1,0 Глюкоза 0, 1 Двуэамещенный натрия фосфат 0,29 Хлористый трифенил- тетразолий 0,07 Альгинат натрия 0,15 Дистиллированная вода Остальное рН после стерилизации 7,2-7,4. Далее ход приготовления лиофилизи- рованной системы микроразведений и способ определения МПК изученных антибиотиков для штамма Е. coli ATCC 2592 аналогичен примеру 1.

Установлено полное совпадение результатов по уровням МПК для всех изученных антибиотиков.

Пример 3. Питательную среду готовят по следующей прописи, мас.%: Ферментолизат биомассы микроорганизмов (осветленный)1,3

0,32

0,14 0,3

Остальное

1

1люкоза

Двузамещенный натрия

фосфат

Хлористый трифенилтетразолий

Альгинат натрия

Дистиллированная

вода

рН после стерилизации 7,2-7,А.

Далее ход приготовления лиофили- зированной системы микроразведений и способ определения МПК изученных антибиотиков для штамма Е coli ATCC 25922 аналогичен примеру 1.

Установлено полное совпадение результатов по уровням МПК для всех изученных антибиотиков.

В табл. 2 представлены результаты определения МПК.

В табл. 2 представлены результаты определения МПК некоторых антибиотико в отношении трех эталонных культур Staphylococcus aureus ATCC 25923, Е. coli ATCC 25922 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Для них известны значения МПК выбранных антибиотиков, которые приведены в табл. 2 (для каждой культуры - правый столбец цифр). В левом столбце приведены результаты определения МПК тех же антибиотиков, полученные с помощью известного способа и с помощью полуавтоматической системы MIC-2000 (известный)

Как видно из табл. 2, модифицированный способ определения МПК антибиотиков позволяет значительно более точно определять уровни антибиотико- чувствительности.

Использование способа позволяет повысить точность определения, упростить и ускорить его за счет использования предварительно заготовленных и лиофилизированных планшетов, которые могут храниться без потери активности антибиотиков в течение 12 мес. при 4°С.

0

5

81

0

5

0

5

97

соль натрия, фосфат и дистиллированную воду, с последующим заполнением лунок титрационного планшета приготовленными разведениями, внесением в них суспензии микроорганизмов, инкубированием посевов и учетов результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, питательная среда дополнительно содержит глюкозу и хлористый трифенил- тетразолий, в качестве источника азота - ферментолнзат биомассы микроорганизмов, в качестве соли натрия - альгинат натрия, в качестве фосфата - пвузамещенный фосфат натрия при сле- цующем соотношении компонентов, мас.%:

Ферментолизат биомассы

микроорганизмов 1,0-1,3

Глюкоза0,1-0,5

Двузамещенный фосфат

натрия0,29-0,32

Хлористый трифенилтетразолий0,07-0,14

Альгинат натрия 0,15-0,3

Дистиллированная

водаОстальное

и учет результатов проводят по изменению цветности среды.

2. Способ по п. 1,отлича ю- щ и и с я тем, что, с целью увеличения сроков хранения готовых план- ШРТОВ, планшеты после заполнения лунок средой с антибиотиком лиофильно высушивают.

Таблица V

40

Антибиотики

Область двукратных I разведений в мкг/мл

45

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к клинико-лабораторным методам исследований. Цель изобретения - повышение точности способа, а также увеличение сроков хранения готовых планшетов. Питательная среда содержит следующее соотношение компонентов, мас.%: ферментолизат биомассы микроорганизмов 1-1,3

глюкоза 0,1-0,5

фосфат натрия двузамещенный 0,29-0,32

хлористый трифенилтетразолий 0,07-0,14

альгинат натрия 0,15-0,3

дистиллированная вода остальное. Готовят двукратные разведения антибиотика и полученные разведения вносят в лунки титрационного планшета. После этого планшеты лиофилизируют. При дальнейшем использовании в лунки вносят суспензию микроорганизмов и инкубируют. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика определяют визуально по изменению темно-вишневого цвета среды. Первая лунка, в которой среда обесцвечивается, соответствует МПК антибиотика. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

Формула изобретения

50

50

ц

Характеристика эталонных культур.