Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент гемопоэтического ростового фактора Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к гибри- домной технологии и может быть использовано при разработке методов лечения болезней крови.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животньк Mus musculus L, продуцирующих гемопозтический (коло- ниестимулирующий) ростовой фактор (КСФ).

Штамм получают следующим образом.

Тимоциты мышей линии AKI ресуспен- |дируют после ввделения и отмывок в

среде 1МДМ в концентрации 2 млн/мл. Среда включает также 5% эмбриональной телячьей сьшоротки (ЭТС), 2 мМ L-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 мМ меркап- тоэтанола, 5 мкг/Мл конвалина А. Клетки тимомыВУ5147 .культивируют в- зтой же среде без добавления кон- канавалина А. Через 48 ч после начала стимуляции тимоцитов конканавали- ном А проводят гибридизацию 2x10 стимулированных тимоцитов и 2x10 .клеток сингенной тимомы в 5147 при . помощи 50%-ного раствора полиэтилен™

сд bo ел о

гликоля мол. массы 4000 в течение 1,5 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтилегликоля клетки высевают в 9б-луночные платы по 1x10 в лунку. Для культивирования и селекции гибридом используют среду 1МДМ г добавлением 10% ЭТС, гипоксантина, 4x10 М аминоптерина, 1,6«. тимидина, а также Ьтлюта мин, меркаптоэтанол, смесь антибиотиков, Гибридомы после наращивания культивируют в среде ШДМ с 10% ЭТС, L- -глютамином, меркаптоэтанолом, смесью антибиотиков. Супернатант культур

гибридных клеток тестируют на содержание КСФ в полутвердых агаровых культурах костномозговых клеток-предшественниц кроветворения мыши. Все полученные гибридомы (количеством 4) спонтанно продуцируют в культураль- ную жидкость гемопоэтический ростовой фактор, стимулировавший образование колоний гранулоцитов и макрофагов в данном тесте. Одни из.исходных гибридом колонировали методом конечных разведе ;ий, высевая по 1 клетке в О,.2 мл питательной среды на лунку, содержащую 4х-10 сингенных спленоци- тов. В результате получен штамм гиб- ридных клеток,-продуцировавший, как и исходная гибридома, гемопоэтический (колониестимулирующий) фактор мьш1и. Штамм получил условное обозначение MKI и депонирован под номером ВСКК (II) № 232 D,

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Культуральные признаки, . . . Стандартные условия культивирования. Среда Шда с 10% эмбриональной телячьей сьшоротки, L-глутамина, 0,05 х1 0 меркаптОэтано- ла, ЮОмкг/мл пенициллина, 1 00 мкг/мл стрептомицина, при и в атмосфере 5% СОг,

Для выращивания штамма использу- ют стеклянную посуду, посевная доза 100-200 тыс, кл,/мл. Культура моно слойная, для диссоциации клеточного монослоя использовали подогретый до 37°С раствор трипсина-версена. Среду культивировали один раз в два-три дня.

Продуктивность штамма, Гемопоэтическая (колонкестимулир.у ющая) активность собранного через 48 ч культивирования штамма в 10-12 раз превьш1ает таковую собранного че

0

5

д 5 Q

5

40

45

50

рез 120 ч культивирования суперкатанта мьшийых спленоцитов, резанных конканавалином А (эталонный образец), .

Характеристика полученного продукта.

Штамм продуцирует мышиный гемопоэтический ростовой фактор, стимулирующий колониеобразование в мышиных агаровых культурах кроветворных клеток-предшественниц, выделенных из костного мозга. Специфичность ростового фактора не определена.

Методы оценки сохранения продукции: тест колонйеобразования в агаровых культурах мышиных костномозговых клеток-предшественниц кроветворения,

(..

Костномозговые клеТки-предшествен - Ницы кроветворения мьш1и очищают от .макрофагов инкубацией на пластике (, 1,5ч), Колониеобразование исследуют в 24-луночных платах Nunc в 0,6 мл культуральной среды, содержащей 0,3% агар, среду 1МДМ, 20% эмбриональной телячьей сьшоротки и 12,5% супернатанта клет,ок штамма, . Контролем служат культуры кроветворных клеток-предшественниц , не содержащие супернатант (отсутствие колонйеобразования).

Стабильность продукции.

Продукция гемопоэтического ростового фактора мьшш сохраняется как минимум до 6 0-ти пассажей in vitro,

Криоконсервирование,

Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сьюоротке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: 1 С/мин до , После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на водяной бане при , Жизнеспособность клеток после размораживания 60-70% по окрашиванию трипановьм синим.

Контаминация.

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наб тодении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при. окрашивании красителями на ДНК и по характеру включения тимидиновой метки.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Продукция гибридными клетками MKI гемопозтического

1.

(колониестимулирующего) ростового фактора мьппй.

Гибридные клетки помещают в стеклянный флакон объемом 50 мл по .1x10 кл./мл в 5 мл питательной среды ШДМ с 10% ЭТС, 2 мМ L-глютамина, по 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола. Клетки культивируют 2-3 дня при в атмосфере 5% СО. Полученный супер- натант используют в качестве образца КСФ в ку,т1ьтурах кроветворных клеток-предшественниц мыши.

Тест на определение биологической активности КСФ в супернатанте культуры гибрццных клеток предлагаемого штамма.

Костномозговые клетки-предшественницы кроветворения вьщеляют из бедренной кости мьш1и линии C57BI и от- мьшают дважды в среде 199 с 5% ЭТС, L-глютамином, меркаптоэтанолом и смесью антибиотиков. После отмьшок клетки ресуспендируют в среде- 1МДМ, содержащей 10% ЭТС и вьппеуказанные .добавки, и инкубируют на пластике (1,5 ч, 37 С, 5% СО) для удаления макрофагов и исключения- тем самьм эндогенного колониеобразования. Затем клетки от- мьшают и ресуспендируют в культураль- ной среде ШДМ, содержащей 0,3% агар Дифко, 20% ЭТС, L-глютамин, меркапто- этаНОЛ и смесь антибиотиков. Прол1 е- рацию исследуют в 24-луночной плате Nunc в присутствии исследуемых образцов. Объем культуры 0,64 мм на лунку, объем тестируемого образца или его разделения 0,08 мл на лунку. В качестве контрольного образца КСФ с известной активностью используют су- пернатант культуры спленоцитов мьш1И, стимулированных митогеном. На 11-е сутки культивирования при 37°С в атмосфере 5% СОг и 100% влажности учитывают колонии под инвертированным микроскопом. За колонию принимают клеточные агрегаты, содержащие не менее 50 клеток.

Результаты опыта представлены в табл. I.

Для доказательства специфичности родукции КСФ гибридными клетками KI исследуют продукцию КСФ в культурах исходных клеток - тимомыВУ51А7 стимулированными конканавалином А

853306

(5 мкг/мл) тимоцитами мыгаей линий

AKR: клетки культивируют 48 ч в среде ШДМ с 10% ЭТС, L-глютамином, мер- g катоэтанолом, смесью антибиотиков, после чего собранные супернатанты тестируют на содержание КСФ. Результаты этого примера свидетельствутот о специфической спонтанной продук- 10 ции клетками предлагаемого штамма гемопоэтического (колониестимулирующего) ростового фактора мьшги.

Пример 2. Влияние рекомби-- нантного фактора некроза опухолей- jt 15 человека на синтез КСФ гибридньми клетками предлагаемого штамма MKI. Гибридные клетки предлагаемого штамма ресуспендируют в среде ШДМ, содержащей 1% ЭТС, L-глютамин, мер- 20 каптоэтанол, смесь антибиотиков

(концентрации указаны выше). Концентрация .клеток 1 млн/мл. Исследования проводят в 24-луночных платах, конечный объем культуры 1 мл на лунку, 25 В- культуры добавляют разные количества рекомбинантного фактора некроза опухолей-0 человека - невидоспе- цифического монокина. Активность РФНО- 0 определяют в цитотоксическом 0 тесте на I929-клетках. Для доказательства специфического влияния рФНО- на продукцию КСФ гибрвдными клетками в параллельных культурах активность РФНО-о( нейтрализуют специфическими мон.оклональньми антителами.

Результаты этого опыта представлены в табл. 2.

Они свидетельствуют о том, что продукция КСФ гибридными клетками штамма прекращается при снижении концентрации ЭТС до 1%. На этом фоне воздействие на гибридные клетки рФНО-в приводит к восстановлению продукции КСФ. При этом наблюдают дозозависимое от рФНО-о увеличение продукции КСФ.

Таким образом, гибридные клетки предлагаемого штамма MKI могут служить моделью для изучения регуляции синтеза КСФ другими лимфокинами и/или монокинами.

5

0

5

Формула изобретение

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. 55 BCKK(II) № 232D - продуцент гемопоэтического ростового фактора.

Таблица 1

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при разработке методов лечения болезней крови. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L, продуцирующих гемопоэтический (колониестимулирующий) ростовой фактор. Штамм получают гибридизацией стимулированных тимоцитов и клеток сингенной тиомы В 5147 при помощи 50%-ного раствора ПЭГ (мол.мас.4000). Штамм получил условное обозначение МК1 и депонирован в ВСКК (П) N 232Д. Клетки культивируют в среде 1МДМ с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 2 .10 -4М Г-глутамина, 0,05*099.10 - 4 меркаптоэтанола, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С в атмосфере 5% CO 2. Посевная доза 100-200 тыс.клеток на 1 мл. Продукция штамма через 48 ч культивирования в 10-12 раз превышает таковую собранного через 120 ч культивирования супернатанта мышиных спленоцитов, стимулированных конкавалином А (эталонный образец). Продукция гемопоэтического ростового фактора мыши сохранятся до 60-ти пассажей IN VITRO. 2 табл.

Супернатант культуры гибридных клеток MKI

Супернатант тимомы BW5147 (48 ч инкубации)

Супернатант тимоцитов АКР, стимулированных конкана- валином (48 ч инкубации)

Контрольный образец КСФ

5

Интактные культуры кроветворных предшественников (без КСФ)

Варианты 4 и 5 характеризуют саму тест-систему.

ло

Таблица 2

63,7t2,0

О

О

9,3tO,7

3,7tO,7

33,3tO,7

24tl,2

ntl,6

р1. мечанне.В опытах использованы моноклональные

антитела против рФНО-о( человек а. Продуцирующую гибридому ЗСГН пассировали in vivo и затем собирали асцити- ческую жидкость, отбирая образцы с высоким содержанием антител по цитотоксичес- кому тесту на 1929-клетках.

1585330

10 Продолжение табл.2