СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНДИЦИОННОЙ СРЕДЫ, ОБЛАДАЮЩЕЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2006 года по МПК A61K35/28 C12N5/06 

Изобретение относится к медицине, конкретно к гематологии и иммунологии, и касается разработки способа получения кондиционной среды, обладающей колониестимулирующей активностью.

Применяемые в настоящее время в гематологии кондиционные среды, обладающие колониестимулирующей активностью, представляют собой преимущественно рекомбинантные гемопоэтические ростовые факторы. Указанные вещества используют, как правило, в двух вариантах: очищенные рекомбинантные ростовые факторы, предназначенные для экспериментальных исследований и обладающие высокой стоимостью, либо официнальные фармакологические препараты гемопоэтинов, которые в силу наличия в них дополнительных веществ (наполнителей) являются малопригодными для лабораторных исследований [5].

Известны способы получения кондиционных сред, обладающих колониестимулирующей активностью, путем использования с этой целью кондиционных сред от иммунокомпетентных клеток (чаще всего спленоцитов), обработанных митогенами (конканавалин А, фитогемагглютинин (ФГА), либо лектин из лаконоса американского (Pokeweed)).

Наиболее близким к предлагаемому способу (прототипом) является способ получения кондиционной среды, обладающей колониестимулирующей активностью: выделяют селезенку от одной интактной мыши CBA/CaLac, гомогенизируют в препаровочной среде следующего состава: 95% RPMI-1640, 5% ЭТС, далее фильтруют через капроновую сеточку и 2-кратно отмывают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10-15 минут. После последнего центрифугирования подсчитывают общее число жизнеспособных кариоцитов и доводят конечную концентрацию до 2×10⁶ спленоцитов/мл средой следующего состава: 10% ЭТС, 1% L-глютамина, 0,2% гентамицина, 0,05% 2-меркаптоэтанола, 89% RPMI-1640 с добавлением ФГА из расчета 10 мкг/мл. Клеточную взвесь оставляют при 37°С, 100% влажности и 5% углекислого газа на 6 суток. По окончании культивирования собирают супернатант, который очищают от клеток путем центрифугирования и хранят при -20°С 3-4 месяца, при -80°С - до 2-х лет [2].

Однако в данных способах вместе с полученными кондиционными средами, обладающими колониестимулирующей активностью, в культуру кроветворных клеток вносятся и остатки митогена, содержащегося в кондиционной среде. Последние оказывают влияние на процессы, происходящие в среде, в частности может иметь место дополнительная неконтролируемая стимуляция колониеобразования [1].

В связи с этим чрезвычайно важное значение приобретает проблема разработки новых доступных для использования в повседневной лабораторной практике способов получения эффективных кондиционных сред, обладающих колониестимулирующей активностью, не оказывающих дополнительного неконтролируемого влияния на процессы колониеобразования.

Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является повышение достоверности и точности способа.

Поставленная в предлагаемом изобретении задача достигается способом получения кондиционной среды, обладающей колониестимулирующей активностью, путем выделения селезенки интактной мыши CBA/CaLac, ее гомогенизации в среде следующего состава: 95% RPMI-1640, 5% ЭТС, фильтрации через капроновую сеточку и 2-кратно отмывания центрифугированием в течение 10-15 минут перед первым отмыванием заливают стерильный гомогенат 1 мл стерильной дистиллированной воды и пипетируют в течение 25 секунд, доводят до 10 мл чистой средой RPMI-1640 и после второго отмывания доводят конечную концентрацию до 2×10⁶ спленоцитов/мл средой следующего состава: 10% ЭТС, 1% L-глютамина, 0,2% гентамицина, 0,05% 2-меркаптоэтанола, 89% RPMI-1640), культивирования взвеси в течение 6 суток при 37°С и хранения надосадка при температуре -20°С не более 1 месяца.

Предлагаемый способ получения кондиционной среды, обладающей колониестимулирующей активностью, выполняют следующим образом: выделяют селезенку интактной мыши CBA/CaLac, ее гомогенизируют в среде следующего состава: 95% RPMI-1640, 5% ЭТС, фильтруют через капроновую сеточку и 2-кратно отмывают центрифугированием в течение 10-15 минут, перед первым отмыванием заливают стерильный гомогенат 1 мл стерильной дистиллированной воды и пипетируют в течение 25 секунд, доводят до 10 мл чистой средой RPMI-1640 и после второго отмывания доводят конечную концентрацию до 2×10⁶ спленоцитов/мл средой следующего состава: 10% ЭТС, 1% L-глютамина, 0,2% гентамицина, 0,05% 2-меркаптоэтанола, 89% RPMI-1640, культивируют взвесь в течение 6 суток при 37°С и хранят надосадок при температуре -20°С не более 1 месяца.

Новым в предлагаемом способе является то, что перед первым отмыванием стерильный гомогенат селезенки заливают 1 мл стерильной дистиллированной воды, пипетируют в течение 25 секунд, доводят до 10 мл чистой средой RPMI-1640.

Известно использование осмотического шока (обработки дистиллированной водой) для очистки клеточной взвеси от эритроцитов [2]. Информации об использовании дистиллированной воды для получения кондиционной среды, обладающей колониестимулирующей активностью, в проанализированной литературе не найдено. Данный способ получения кондиционной среды, обладающей колониестимулирующей активностью, апробирован в НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, таким образом, он соответствует критерию изобретения «промышленно применимо».

Для определения колониестимулирующих свойств кондиционной среды спленоцитов, обработанных дистиллированной водой, и сравнения с известными способами поставлены пробы в трех вариантах. Исследования выполнены на 28 мышах-самцах линии CBA/CaLac в возрасте 2-2,5 месяцев (по 7 в группе). Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из коллекционного фонда лаборатории экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). Перед взятием материала мышей умерщвляли методом дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом.

Выделенные в стерильных условиях селезенки подвергали гомогенизации в препаративной среде (95% RPMI-1640, 5% ЭТС), фильтровали через капроновую сеточку, отмывали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 минут средой RPMI-1640, сливали надосадочную жидкость.

Стерильный гомогенат селезенки от животных 1-й группы (контроль) ресуспендировали и подсчитывали (с помощью трипанового синего) общее число жизнеспособных кариоцитов. Доводили конечную концентрацию клеток до 2×10⁶ кл./мл средой следующего состава: 10% ЭТС, 1% L-глютамина, 0,2% гентамицина, 0,05% 2-меркаптоэтанола, 89% RPMI-1640.

Способ - прототип: стерильный гомогенат селезенки от животных 2-й группы ресуспендировали и подсчитывали (с помощью трипанового синего) общее число жизнеспособных кариоцитов. Доводили конечную концентрацию спленоцитов до 2×10⁶ кл./мл средой следующего состава: 10% ЭТС, 1% L-глютамина, 0,2% гентамицина, 0,05% 2-меркаптоэтанола, 89% RPMI-1640 и добавляли ФГА ("Sigma", США) из расчета 10 мкг/мл.

Предлагаемый способ: в стерильный гомогенат селезенки от животных 3-й группы добавляли стерильную дистиллированную воду на 25 сек., затем немедленно 10 мл среды RPMI-1640, фильтровали через капроновую сеточку и отмывали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость заменяли препаративной средой (95% RPMI-1640, 5% ЭТС), клеточную взвесь ресуспендировали и подсчитывали (с помощью трипанового синего) общее число жизнеспособных кариоцитов. Доводили конечную концентрацию клеток до 2×10⁶ кл./мл средой следующего состава: 10% ЭТС, 1% L-глютамина, 0,2% гентамицина, 0,05% 2-меркаптоэтанола, 89% RPMI-1640.

Полученная смесь инкубировалась в каждом случае в течение 6 суток при температуре 37°C.

По истечении 6-и сут инкубации кондиционные среды клеток центрифугировали, собирали супернатанты и применяли для стимуляции роста семи дневных гранулоцитомакрофагальных колоний in vitro в среде следующего состава: 80% среды RPMI-1640 ("Serva", ФРГ), 19% ЭТС ("Sigma", США), 280 мг/л L-глутамина ("Sigma", США), 1% метилцеллюлозы ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ) с добавлением 10% супернатантов от каждой из 3-х групп, задействованных в эксперименте [2].

Клетки для тест-системы получали следующим образом: костный мозг выделяли из бедренной кости мыши 0,5 мл препаративной среды (95% RPMI-1640, 5% ЭТС), суспендировали и подсчитывали общее количество миелокариоцитов, определяя их жизнеспособность. Затем удаляли адгезирующие клетки путем преинкубации 1 мл клеточной взвеси с клеточностью 10¹⁰/л в течение 1 часа в пластиковых чашках Петри (37°С, 100% влажность). Неприлипающие элементы доводили до 2,0×10⁵/мл и по 0,5 мл приготовленной взвеси помещали в 24-луночные пластиковые планшеты («Costar», США) и инкубировали в течение 7 суток в СО₂ инкубаторе («Jouan», Франция) при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха. После инкубации подсчитывали число колоний. Под колонией подразумевали образовавшийся в культуре очаг гемопоэза, содержащий более 50 клеток. Подсчет колоний производили под бинокулярным микроскопом МБС-9 (ув.56х). Число КОЕ-ГМ рассчитывали на 10⁵ неадгезирующих миелокариоцитов.

Полученные результаты обрабатывали методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента [4].

Результаты исследования

Проведенные эксперименты показали, что кондиционная среда от спленоцитов, обработанных дистиллированной водой, не уступают по активности применению кондиционной среды от спленоцитов, прошедших предварительную обработку фитогемагглютинином (опытные группы) и оказывает выраженное стимулирующее влияние на рост клеток-предшественников грануломоноцитопоэза типа КОЕ-ГМ в сравнении с ростом колоний под действием кондиционной среды от спленоцитов, не подвергнутых никакому воздействию (контрольная группа). Так, достоверная разница между показателями контрольной и опытных групп выявлялась во всех сериях экспериментов (табл.1). При этом значения показателей колониеобразования (число КОЕ-ГМ) в группах с использованием кондиционных сред от спленоцитов, обработанных дистиллированной водой и ФГА, в среднем в 2-3 раза превышало данный показатель в группе, где в качестве стимулятора использовали среду от интактных спленоцитов. Следует подчеркнуть, что в то же время применение дистиллированной воды оказалось наиболее эффективным. Число КОЕ-ГМ при вышеназванном способе стимуляции превосходило в среднем в 2 раза показатели в группе, где для стимуляции роста гранулоцитомакрофагальных колоний использовались кондиционные среды от спленоцитов, обработанных ФГА. Основной положительный эффект при использовании предлагаемого способа заключался в повышенной чистоте эксперимента, точности и достоверности полученных результатов, вследствие того, что в культуру кроветворных клеток не вносятся остатки митогена, содержащегося в кондиционной среде, которые оказывают влияние на процессы, происходящие в среде, тем самым снижают точность и достоверность способа.

Таким образом, проведенные исследования показали, что применение кондиционной среды от спленоцитов, предварительно обработанных дистиллированной водой, по способности стимулировать рост гранулоцитарномакрофагальных колоний in vitro превосходит способ-прототип, а результаты, полученные таким способом, более точны и достоверны.

Таблица 1Количество гранулоцитарномакрофагальных колоний (КОЕ-ГМ×10⁵ нуклеаров), выросших из клеток костного мозга интактных мышей линии CBA/CaLaC в зависимости от используемого средства, стимулирующего рост колоний in vitro (X±m; Р)СтимуляторСерии экспериментов 123Без стимулятора2,33±0,82
**3,33±0,821,50±0,55
**Фитогемагглютинин5,00±0,89
*4,17±0,757,00±0,89
*Дистиллированная вода9,67±0,82
* **11,00±1,26
* **14,33±0,82
* *** - достоверность различий с контролем (без применения стимулятора) ** - достоверность различий с группой 2 (стимуляция роста колоний фитогемаглютинином)

Источники информации

1. Галактионов В.Г. Иммунология. - М.: Медицина, 1998. - 479 с.

2. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с. - прототип.

3. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шерстобоев Е.Ю. Механизмы локальной регуляции кроветворения. - Томск: STT, 2000. - 148 с.

4. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа. - 1973. - 215 с.

5. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух частях. 4.2. - 12-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1993. - 736 с.

6. Петров Р.В. Иммунология. - М.: Медицина, 1983. - 368 с.

Изобретение относится к медицине, конкретно к гематологии и иммунологии, и касается разработки способа получения кондиционной среды, обладающей колониестимулирующей активностью. Способ заключается в том, что селезенку интактной мыши CBA/CaLac гомогенизируют в среде следующего состава: 95% RPMI-1640, 5% ЭТС, фильтруют через капроновую сетку, отмывают центрифугированием средой RPMI-1640 при 1500 об/мин в течение 10-15 минут, доводят конечную концентрацию жизнеспособных спленоцитов до 2×10⁶ кл./мл средой, содержащей 10% ЭТС, 1% L-глютамина, 0,2% гентамицина, 0,05% 2-меркаптоэтанола, 89% RPMI-1640, культивируют при 37°С в течение 6 суток, центрифугируют и отделяют супернатант, содержащий целевой продукт с последующим хранением его при -20°С, при этом перед фильтрацией добавляют к стерильному гомогенату селезенки 1 мл дистиллированной воды на 25 сек и затем немедленно 10 мл среды RPMI-1640, а целевой продукт хранят не более 1 месяца. Способ обеспечивает повышение достоверности и точности. 1 табл.

Способ получения кондиционной среды, обладающей колониестимулирующей активностью, путем гомогенизации селезенки интактной мыши CBA/CaLac в среде следующего состава: 95% RPMI-1640, 5% ЭТС, фильтрации через капроновую сетку, отмывания центрифугированием средой RPMI-1640 при 1500 об/мин в течение 10-15 мин, доведения конечной концентрации жизнеспособных спленоцитов до 2×10⁶ клеток/мл средой следующего состава: 10% ЭТС, 1% L-глютамина, 0,2% гентамицина, 0,05% 2-меркаптоэтанола, 89% RPMI-1640, культивирования при 37°С в течение 6 суток, центрифугирования и отделения супернатанта, содержащего целевой продукт, с последующим хранением его при -20°С, отличающийся тем, что перед фильтрацией добавляют к стерильному гомогенату селезенки 1 мл дистиллированной воды на 25 с и затем немедленно 10 мл среды RPMI-1640, а целевой продукт хранят не более 1 месяца.