Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклонального антитела, нейтрализующего биологическую активность человеческого фактора некроза опухолей-альфа Советский патент 1989 года по МПК C12N15/00 A61K39/395 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано для определения и нейтрализации фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-Ю.

Цель изобретения - получение штамма, продуцирующего моноклональное антитело к ФНО-в/, с повьшенной нейтрализующей способностью в отношении клеточного ФНО-Л

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BaLb/C иммунизируют по 2-недельной схеме. 20 мкг Р ФНО-о (рекомбинантньй фактор некроза опухолей-альфа) в 0,15 мл 0,15 К NaCl в смеси с равным объемом полного адъю- ,ванта Фрейнда дважды вводят внутри- брюшинно с интервалом в 7 дней. За 3,2 и 1 день до слияния 10 мкг Р ФИО-о

вводят ВНуТрИбрЮШИННО в 0,5 МП

0,15 М NaCl. Гибридизацию 1,2x10 клеток селезенки иммунных мьш1ей и 4x10 клеток миеломы мьшш Xb3-Ag8-653 про- эодят 50%-ным раствором полиэтилен- гликоля мол. массы 4000, содержащего 5% диметилсульфоксида, в течение 1,Ь мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля клетки

Oi

lN5

гзысевллот в 96-луночные панели по tx10 сплепоцитов в пупку Для культивирования и селекции гибридом используют среду 1МДК (модифшщрованная ISkeve S среда Дульбекко) с добав- лйнием 10% эмбриональной телячьей сы BOpoTiu-i (ЭТС), гипоксактина аминоптерина и 1,6к 10 Н ти- мндина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разв.едений. нысевая но 1 клетке в лункуj содержащую 4x10 клеток селезенки. После 2 клонирований практически 100% субклонов продуцируют моноклональные антитела (монЛТ) к Р ФНО--С/, Продукция антитела сохраняется- как NraHHMyM в те- 4eHJie 15 пассажей в культуре.

Штамм 3C7N депонирован нод номером ВСКК (П) № 170D и характеризуется CJIeдyIoц и Ш примерами.

Культуральные признаки

Стандартные условия культивирования. Среда 1ШМ с 10% донорской телячьей сыворотки5 2х10 М 1-глутанина, 100 мкг/мл пенигщллина, 100 стрепто ип,ина, 0,05x10 М мерканто- этанола, при 37°С и в атмосфере 5% СО-/.. Для выращивания штамма исноль- зую1 стеклянную носуду, посе)зная доза 100-200 тыс.. кл. на 1 мл, клетки

пассируют один раз

дня, кратность рассева 1гб-1;8, Культура сус- - пенз1-и л-и-1ая,

Культивирование в организме животных. Для вырак ивання асцита пригодны мыши . Mышa за 7-30 дней до инъекн,-П1 клеток штамма вводят внутри- б р гонги и и о по О , 5 мл пр и с т а на. Кл е т к и инъе.ч,иру;от внутрибрюншнно но 2-5x10 клеток в 1 мл средь IMDM, Асцит форми- {дуется через 12-14 дней.

Конта.ч инахщя Бактерии и грибы в кулы З/ре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение г-шкоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК ,и по характеру включения тид-гиди- новой метки.

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в стеклянный флакон объемом 50 мл по 1x10 клеток в 5 мл среды с 10% ЭТС, 2мМ Ь-г потамина, 100 мкг/мл пенищллина и стрептомитлина, 0,05 мМ. меркаптоэтанола. Клетки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере 5% 00. Полученный супернатант используют в качестве реаген7 а в иммунохимических реакциях.

Тест на определение специфичности взаимодействия монАТ с антигенами, иммобилизированными на пластике.

Используемый метод: иммунофер- ментньй анализ

Р ФНО-о, Р ФИО-/3 и бычий сыворо-- точкьм альбумин (БСА) в количестве

40

45

Биосинтез полезного продукта. Сек- мкг в 50 мкл 0,1 М карбонатного

50 буфера, рН 9,6, вносят в лунки 96-яче- ечных микроплат и сорбируют ночь при 4 С. После отмывок и ячейки вносят по 50 MIUI культур ал ьной среды штамма 3C7N или разведенных 1:5000 в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 1% БСА (ЗФР-БСА) поликлональных кроличьих антител, специфичньш к Р

реция моноклонального-антитела па 2-3-день культивирования составляет 11-15 мкг/мл культуральной среды н мт в 1 ivffl асцитной жидкости при определеш1И иммуноферментным методом

Хар а 1C те ряс тика полученнот о продук-. та. Штамм гфодущфует моноклональное антитело JgGI, Специфичность йНО- Ы.

ФНО-с/. Панель инкубируют 2 ч при 20 С,

10

15

20

-

-

21776.4

Методы оценки сохранения специфичности г тест на связьшание монАТ с им- мобилизированным ФИО-с/ (иммунофер-- ментный анализ). Антиген сорбируют на пластике: 500 нг в 50 мкл 0,1 М бикарбонатного буфера, рН 9,6, ночь при . Затем, после отмывки, наносят тестируемую культуральную среду и после инкубации и отмывки определяют количество сорбированных антител, мечеными пероксидазой кроличьими ан- тимыишными антителами. Все отмывки проводят бидистиллированной водой. Контролем служит бьиий сывороточный альбуми в качестве антигена.

Стабильность продукции. Продукция монЛТ сохраняется как минимум до 15 пассалсей in vitro. В асцитной форме штамм не пассировался более одного раза.

К,риоконсервирование, Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добатзлением 10% диметилсульфок- сида. Режим замораживазшя: l С/мин до минус . После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Раз- моралшвание на водяной бане 37°С. Жизнеспособность клеток после размо- ралшвания 60-70% по окрашиванию три- нановым синим.

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в стеклянный флакон объемом 50 мл по 1x10 клеток в 5 мл среды с 10% ЭТС, 2мМ Ь-г потамина, 100 мкг/мл пенищллина и стрептомитлина, 0,05 мМ. меркаптоэтанола. Клетки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере 5% 00. Полученный супернатант используют в качестве реаген7 а в иммунохимических реакциях.

Тест на определение специфичности взаимодействия монАТ с антигенами, иммобилизированными на пластике.

Используемый метод: иммунофер- ментньй анализ

Р ФНО-о, Р ФИО-/3 и бычий сыворо-- точкьм альбумин (БСА) в количестве

25

30

40

45

ФНО-с/. Панель инкубируют 2 ч при 20 С,

атем отмывают 5 раз бидистиллирован- ной водой и вносят по 50 мкл в лунку кроличьи противомьпшные антитела, ме- ченые пероксидазой, разведенные 1/2500 в ЗФР-ВСА и меченые пероксида- зой противокроличьи антитела, разведенные 1/2500 в ЗФР-БСА. После инку- бадаи в течение 1 ч при 20°С плату . отмывают и в лунки добавляют субстрат Q ортофенилендиамин гидрохлорид,0, мг/мп в цитратно-фосфатном буфере, рН 4,7, содержащем 0,03% Н,0 . Реакцию останавливают через 10 мин 1 М серной кислоты и учитывают на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

Результаты опыта по изучению спе- , цифичности связьшания монАТ продуци- руемого клетками штамма 3C7N, с ан- 20 тигенами, иммобилизированными на плас- тике, представлены в табл. 1,

Результаты этого примера свидетельствуют о высокой специфичности монАТ, jr вырабатываемого клетками штамма 3C7N, и показывают возможность применения этого монАТ для определения ФНО-с с помощью иммуноферментного метода.

При мер 2. Биологическую активность различных образцов ФИО определяют по лизису клеток мышиной.фиб- робластоидной линии L929 в присутствии актиномидана Д. Накануне теста клетки L929 рассеивают по 50 тыс. в лунку в плоскодонные 96-ячеечные мик- 5 роплаты в минимальной среде, модифицированной Дул ьбекко (ДМЕМ) с 5% ЭТС, глютамином меркаптоэтанолом, пенициллином и стрептоцимином. Образцы, содержащие ФИО, раститровывают в отдельной плате в объеме 50 мкл, вносят 50 М1СП соответствующего разведения антител и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. После инкубации образцы переносят в плату с клетками L-929, добавляют актиномицин Д до

30

40

45

Q

0

r

5

0

концентрации 1 мкг/мл и помещают в термостат с температурой З7 с на 16- 20 ч. Результаты учитываюФ после окрашивания клеток 0,2%-ным раствором генцианвиолета в 2%-ном метаноле в течение 10-12 мин. Оптическую плотность лунок измеряют при длине волны 540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучом. Лизису клеток L-929 соответствует снижение оптической плотности лунок. За единицу биологической активности образцов ФИО принимают то их разведение, которое вы- зьшает 50% по отношению к интактным лизис клеток.

Результаты опыта по нейтрализации биологической активности ФНО-of монАТ штамма ЗСУН представлены в табл. 2. Данные этого примера свидетельствуют об эффективной нейтрализации биологической активности как рекомби- нантного, так и клеточного ФИО-с/ монАТ штамма 3C7N, при этом в случае р ФНО-о необходимо разведение асцита 1:1600, клеточного 1:2400.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П) № 170D - продуцент моноклонального антитела, нейтрализующего биологическую активность человеческого фактора

некроза опухолей-альфа.

Таблица 1

5

40

5

45

А492 - оптическая плотность лунок при 492 нм.

Т а б л -и ц а 2

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения и нейтрализации фактора некроза опухолей = альфа (ФНО=α). Цель изобретения - получение штамма, продуцирующего моноклональное антитело к ФНО=α с повышенной нейтрализующей способностью в отношении клеточного ФНО=α. Штамм получен путем иммунизации мышей линии BALB/C рекомбинантным ФНО=α. Далее гибридизуют клетки селезенки миеломы мыши Х63=AG8=653 и затем проводят селекцию и клонирование. Получают штамм 3C7N, который депонирован под номером ВСКК(П)N170Д. Штамм продуцирует монАТ JGG1, специфичность - ФНО=α. МонАТ штамма 3C7N нейтрализует как рекомбинантный, так и клеточный ФНО=α, при этом в случае рекомбинантного ФНО=α необходимо разведение асцита 1:1600, в случае клеточного 1:2400. 2 табл.

1136

Клеточный ФИО-с получен в результате стимуляции периферических мононуклеаров крови человека 5 мкг/мл ФГА в течение 24 ч при .

1274

1 123