Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклонального антитела, нейтрализующего биологическую активность человеческого фактора некроза опухолей-альфа Советский патент 1989 года по МПК C12N15/00 A61K39/395 

Описание патента на изобретение SU1521776A1

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано для определения и нейтрализации фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-Ю.

Цель изобретения - получение штамма, продуцирующего моноклональное антитело к ФНО-в/, с повьшенной нейтрализующей способностью в отношении клеточного ФНО-Л

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BaLb/C иммунизируют по 2-недельной схеме. 20 мкг Р ФНО-о (рекомбинантньй фактор некроза опухолей-альфа) в 0,15 мл 0,15 К NaCl в смеси с равным объемом полного адъю- ,ванта Фрейнда дважды вводят внутри- брюшинно с интервалом в 7 дней. За 3,2 и 1 день до слияния 10 мкг Р ФИО-о

вводят ВНуТрИбрЮШИННО в 0,5 МП

0,15 М NaCl. Гибридизацию 1,2x10 клеток селезенки иммунных мьш1ей и 4x10 клеток миеломы мьшш Xb3-Ag8-653 про- эодят 50%-ным раствором полиэтилен- гликоля мол. массы 4000, содержащего 5% диметилсульфоксида, в течение 1,Ь мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля клетки

Oi

lN5

гзысевллот в 96-луночные панели по tx10 сплепоцитов в пупку Для культивирования и селекции гибридом используют среду 1МДК (модифшщрованная ISkeve S среда Дульбекко) с добав- лйнием 10% эмбриональной телячьей сы BOpoTiu-i (ЭТС), гипоксактина аминоптерина и 1,6к 10 Н ти- мндина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разв.едений. нысевая но 1 клетке в лункуj содержащую 4x10 клеток селезенки. После 2 клонирований практически 100% субклонов продуцируют моноклональные антитела (монЛТ) к Р ФНО--С/, Продукция антитела сохраняется- как NraHHMyM в те- 4eHJie 15 пассажей в культуре.

Штамм 3C7N депонирован нод номером ВСКК (П) № 170D и характеризуется CJIeдyIoц и Ш примерами.

Культуральные признаки

Стандартные условия культивирования. Среда 1ШМ с 10% донорской телячьей сыворотки5 2х10 М 1-глутанина, 100 мкг/мл пенигщллина, 100 стрепто ип,ина, 0,05x10 М мерканто- этанола, при 37°С и в атмосфере 5% СО-/.. Для выращивания штамма исноль- зую1 стеклянную носуду, посе)зная доза 100-200 тыс.. кл. на 1 мл, клетки

пассируют один раз

дня, кратность рассева 1гб-1;8, Культура сус- - пенз1-и л-и-1ая,

Культивирование в организме животных. Для вырак ивання асцита пригодны мыши . Mышa за 7-30 дней до инъекн,-П1 клеток штамма вводят внутри- б р гонги и и о по О , 5 мл пр и с т а на. Кл е т к и инъе.ч,иру;от внутрибрюншнно но 2-5x10 клеток в 1 мл средь IMDM, Асцит форми- {дуется через 12-14 дней.

Конта.ч инахщя Бактерии и грибы в кулы З/ре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение г-шкоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК ,и по характеру включения тид-гиди- новой метки.

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в стеклянный флакон объемом 50 мл по 1x10 клеток в 5 мл среды с 10% ЭТС, 2мМ Ь-г потамина, 100 мкг/мл пенищллина и стрептомитлина, 0,05 мМ. меркаптоэтанола. Клетки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере 5% 00. Полученный супернатант используют в качестве реаген7 а в иммунохимических реакциях.

Тест на определение специфичности взаимодействия монАТ с антигенами, иммобилизированными на пластике.

Используемый метод: иммунофер- ментньй анализ

Р ФНО-о, Р ФИО-/3 и бычий сыворо-- точкьм альбумин (БСА) в количестве

40

45

Биосинтез полезного продукта. Сек- мкг в 50 мкл 0,1 М карбонатного

50 буфера, рН 9,6, вносят в лунки 96-яче- ечных микроплат и сорбируют ночь при 4 С. После отмывок и ячейки вносят по 50 MIUI культур ал ьной среды штамма 3C7N или разведенных 1:5000 в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 1% БСА (ЗФР-БСА) поликлональных кроличьих антител, специфичньш к Р

реция моноклонального-антитела па 2-3-день культивирования составляет 11-15 мкг/мл культуральной среды н мт в 1 ivffl асцитной жидкости при определеш1И иммуноферментным методом

Хар а 1C те ряс тика полученнот о продук-. та. Штамм гфодущфует моноклональное антитело JgGI, Специфичность йНО- Ы.

ФНО-с/. Панель инкубируют 2 ч при 20 С,

10

15

20

-

-

21776.4

Методы оценки сохранения специфичности г тест на связьшание монАТ с им- мобилизированным ФИО-с/ (иммунофер-- ментный анализ). Антиген сорбируют на пластике: 500 нг в 50 мкл 0,1 М бикарбонатного буфера, рН 9,6, ночь при . Затем, после отмывки, наносят тестируемую культуральную среду и после инкубации и отмывки определяют количество сорбированных антител, мечеными пероксидазой кроличьими ан- тимыишными антителами. Все отмывки проводят бидистиллированной водой. Контролем служит бьиий сывороточный альбуми в качестве антигена.

Стабильность продукции. Продукция монЛТ сохраняется как минимум до 15 пассалсей in vitro. В асцитной форме штамм не пассировался более одного раза.

К,риоконсервирование, Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добатзлением 10% диметилсульфок- сида. Режим замораживазшя: l С/мин до минус . После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Раз- моралшвание на водяной бане 37°С. Жизнеспособность клеток после размо- ралшвания 60-70% по окрашиванию три- нановым синим.

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в стеклянный флакон объемом 50 мл по 1x10 клеток в 5 мл среды с 10% ЭТС, 2мМ Ь-г потамина, 100 мкг/мл пенищллина и стрептомитлина, 0,05 мМ. меркаптоэтанола. Клетки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере 5% 00. Полученный супернатант используют в качестве реаген7 а в иммунохимических реакциях.

Тест на определение специфичности взаимодействия монАТ с антигенами, иммобилизированными на пластике.

Используемый метод: иммунофер- ментньй анализ

Р ФНО-о, Р ФИО-/3 и бычий сыворо-- точкьм альбумин (БСА) в количестве

25

30

40

45

ФНО-с/. Панель инкубируют 2 ч при 20 С,

атем отмывают 5 раз бидистиллирован- ной водой и вносят по 50 мкл в лунку кроличьи противомьпшные антитела, ме- ченые пероксидазой, разведенные 1/2500 в ЗФР-ВСА и меченые пероксида- зой противокроличьи антитела, разведенные 1/2500 в ЗФР-БСА. После инку- бадаи в течение 1 ч при 20°С плату . отмывают и в лунки добавляют субстрат Q ортофенилендиамин гидрохлорид,0, мг/мп в цитратно-фосфатном буфере, рН 4,7, содержащем 0,03% Н,0 . Реакцию останавливают через 10 мин 1 М серной кислоты и учитывают на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

Результаты опыта по изучению спе- , цифичности связьшания монАТ продуци- руемого клетками штамма 3C7N, с ан- 20 тигенами, иммобилизированными на плас- тике, представлены в табл. 1,

Результаты этого примера свидетельствуют о высокой специфичности монАТ, jr вырабатываемого клетками штамма 3C7N, и показывают возможность применения этого монАТ для определения ФНО-с с помощью иммуноферментного метода.

При мер 2. Биологическую активность различных образцов ФИО определяют по лизису клеток мышиной.фиб- робластоидной линии L929 в присутствии актиномидана Д. Накануне теста клетки L929 рассеивают по 50 тыс. в лунку в плоскодонные 96-ячеечные мик- 5 роплаты в минимальной среде, модифицированной Дул ьбекко (ДМЕМ) с 5% ЭТС, глютамином меркаптоэтанолом, пенициллином и стрептоцимином. Образцы, содержащие ФИО, раститровывают в отдельной плате в объеме 50 мкл, вносят 50 М1СП соответствующего разведения антител и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. После инкубации образцы переносят в плату с клетками L-929, добавляют актиномицин Д до

30

40

45

Q

0

r

5

0

концентрации 1 мкг/мл и помещают в термостат с температурой З7 с на 16- 20 ч. Результаты учитываюФ после окрашивания клеток 0,2%-ным раствором генцианвиолета в 2%-ном метаноле в течение 10-12 мин. Оптическую плотность лунок измеряют при длине волны 540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучом. Лизису клеток L-929 соответствует снижение оптической плотности лунок. За единицу биологической активности образцов ФИО принимают то их разведение, которое вы- зьшает 50% по отношению к интактным лизис клеток.

Результаты опыта по нейтрализации биологической активности ФНО-of монАТ штамма ЗСУН представлены в табл. 2. Данные этого примера свидетельствуют об эффективной нейтрализации биологической активности как рекомби- нантного, так и клеточного ФИО-с/ монАТ штамма 3C7N, при этом в случае р ФНО-о необходимо разведение асцита 1:1600, клеточного 1:2400.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П) № 170D - продуцент моноклонального антитела, нейтрализующего биологическую активность человеческого фактора

некроза опухолей-альфа.

Таблица 1

5

40

5

45

А492 - оптическая плотность лунок при 492 нм.

Т а б л -и ц а 2

Похожие патенты SU1521776A1

название год авторы номер документа
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей - альфа человека 1987
  • Панютич Александр Васильевич
  • Войтенок Николай Николаевич
  • Турецкая Регина Лазаревна
SU1530638A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS-продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей-альфа человека 1987
  • Панютич Александр Васильевич
  • Войтенок Николай Николаевич
  • Турецкая Регина Лазаревна
  • Шахов Александр Николаевич
  • Недоспасов Сергей Артурович
  • Чувпило Сергей Альбертович
  • Шингарова Людмила Николаевна
  • Добрынин Владимир Николаевич
  • Коробко Вячеслав Григорьевич
SU1507791A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклональных антител к фактору некроза опухоли @ человека 1988
  • Беркова Надежда Петровна
  • Коробко Вячеслав Григорьевич
  • Шамборант Ольга Георгиевна
  • Добрынин Владимир Николаевич
  • Чувпило Сергей Альбертович
SU1585329A1
Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUSL, используемый для получения моноклональных антител к рекомбинантному @ - фактору некроза опухолей человека 1991
  • Шидловская Елена Александровна
  • Панютич Александр Васильевич
  • Лях Людмила Антоновна
  • Петевка Наталия Васильевна
  • Войтенок Николай Николаевич
  • Мисуно Наталия Ивановна
  • Колесникова Татьяна Сергеевна
SU1747484A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый для получения моноклональных антител к мембранному белку ЕSснеRIснIа coLI в препарате рекомбинантного интерлейкина-2 человека 1987
  • Панютич Александр Васильевич
  • Войтенок Николай Николаевич
  • Осипович Олег Анатолиевич
  • Циманис Александр Юрьевич
SU1446154A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к липополисахариду ЕSснеRIснIа coLI 1987
  • Панютич Александр Васильевич
  • Войтенок Николай Николаевич
  • Циманис Александр Юрьевич
  • Бундулис Юрис Петрович
  • Скривелис Виталий Андрисович
SU1472497A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к @ - тимозину 1988
  • Попов Борис Валентинович
  • Попова Изольда Александровна
  • Лившиц Вадим Аронович
  • Салова Ольга Федоровна
  • Калихевич Виктор Николаевич
  • Ардемасова Зоя Александровна
SU1527260A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS. мUSсULUS L., используемый для получения моноклональных антител к теофиллину 1989
  • Василов Раиф Гаянович
  • Данилова Надеждад Петровна
SU1673597A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к гликопротеиду Е1 вируса восточного энцефаломиелита лошадей 1989
  • Перебоев Александр Владимирович
  • Агапов Евгений Васильевич
  • Разумов Иван Алексеевич
  • Локтев Валерий Борисович
SU1671688A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS.мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к тиреотропному гормону человека 1989
  • Василов Раиф Гаянович
  • Втюрина Ирина Юрьевна
  • Вайль Кирилл Юрьевич
SU1685997A1

Реферат патента 1989 года Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклонального антитела, нейтрализующего биологическую активность человеческого фактора некроза опухолей-альфа

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения и нейтрализации фактора некроза опухолей = альфа (ФНО=α). Цель изобретения - получение штамма, продуцирующего моноклональное антитело к ФНО=α с повышенной нейтрализующей способностью в отношении клеточного ФНО=α. Штамм получен путем иммунизации мышей линии BALB/C рекомбинантным ФНО=α. Далее гибридизуют клетки селезенки миеломы мыши Х63=AG8=653 и затем проводят селекцию и клонирование. Получают штамм 3C7N, который депонирован под номером ВСКК(П)N170Д. Штамм продуцирует монАТ JGG1, специфичность - ФНО=α. МонАТ штамма 3C7N нейтрализует как рекомбинантный, так и клеточный ФНО=α, при этом в случае рекомбинантного ФНО=α необходимо разведение асцита 1:1600, в случае клеточного 1:2400. 2 табл.

Формула изобретения SU 1 521 776 A1

1136

Клеточный ФИО-с получен в результате стимуляции периферических мононуклеаров крови человека 5 мкг/мл ФГА в течение 24 ч при .

1274

1 123

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1989 года SU1521776A1

Liang С.М
et
al, Biochem
Biop- jlujs
Res
Coram
Пневматический водоподъемный аппарат-двигатель 1917
  • Кочубей М.П.
SU1986A1
Способ приготовления строительного изолирующего материала 1923
  • Галахов П.Г.
SU137A1

SU 1 521 776 A1

Авторы

Панютич Александр Васильевич

Войтенок Николай Николаевич

Турецкая Регина Лазаревна

Шахов Александр Николаевич

Недоспасов Сергей Артурович

Чувпило Сергей Альбертович

Шингарова Людмила Николаевна

Добрынин Владимир Николаевич

Коробко Вячеслав Григорьевич

Даты

1989-11-15Публикация

1987-12-29Подача