Способ получения моноспецифических антисывороток Советский патент 1991 года по МПК A61K39/285 

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к иммунохимии, молекулярной биологии идиагностике инфекций.

Способы получения моноспецифических антисьшороток к индивидуальным полипептидамJ входяп им в состав сложных белковых смесей, включают в себя два независимыхэтапа. На первом этапе с помощью определенного набора биохимических процедур вьщеляют исследуемый индивидуальный белок-. На вто- ipoM этапе вьделенным белком-анти- j геном иммунизируют животных-продуцентов .

Целью изобретения является повышение активности целевого пр.одукта, с: одновременным снижением количества

антигена, используемого для им ryнизации.

Это достигается комбинированной иммунизацией ж1-1вотных-продуцентов раствором белка-антигена в смеси с адъювантом Фрейнда, а затем - в составе измельченного полиакриламидного геля, что позволяет получать высокотитражные антисыворотки, исходя из очень малых количеств антигена.

Способ осуществляют следующим об

разомо

Сложную смесь белков подвергают .электрофоретическому разделению в полиакриламидном геле в присутствии 0,1%-ного lUlC-Na. После окончания электрофореза для удаления ДДС-Na гель вь держивают в 20 объемах 50%-ноО100 «ч ГО

,j;&.

го (об/об) водного раствора этанола, ирокраимвают в 0,1%-ной водной сус- тензии Кумасси ярко-синего R-250 и отмывают фон 10%-ным (об/об) водным раствором этанола. Окрашенную зону исследуемого белка вьфезают, гель измельчают и отмывают от связанного с Мелком красителя 50%-ным водным раствором этанола. Элюатщю белка из геля проводят свободной диффузией в буфере, содержащем 2% ДДС-Na и 5%-/З-мер- каптоэтанола, в течение 48 ч. После этого частички геля и водную фазу разделяют и диализуют по отдельности против физиологического раствора. 1/2 часть элюата смешивают с равным |объемом полного адъюванта Фрейнда и вводят подкожно кроликам. Через 14 дНо кроликов повторно иммунизируют подкожно оставшейся частью элюата в смеси с неполным адъювантом Фрейн- ;:да. Через 14 дн. после второй иммуни- зации кроликам вводят подкожно из- мельченнбш полиакриламидный гель с оставшимся в нем некоторым количеством белка-антигена. Через неделю после третьей иммунизации у животных берут кровь, из которой стандартным способом получают иммунную сыворотку Пример, Получение моноспецифических антисывороток к структурным белкам оболочки вируса осповак- цины.

. 2 мг вируса осповакцины (ВОВ) ре- суспендировали в 1 мл буфера (0,01 М трис-HCl, рН 9,0, 0,5% NP-40), инкубировали 30 мин при 37 С и центрифугировали 30 мин при 30000g. Супер- натант обозначили, как NP-40-фракцию Аналогично получали 2-меркаптоэтанол фракцию обработкой вируса 0,02 М 2- меркаптоэтанолом. Оеадок представляе собой сердцевину ПОВ. Электрофорез проводили в 15%-ном полиакриламидком геле в прерывистой буферной системе в присутствии 0,1%;mC-Na.

К фракциям NP-40 и 2-меркаптоэтанол добавили /UlC-Na до 2% и 2-меркаптоэтанол до 5% и прогрели в течение 2 мин на кипящей бане. Элект рофорез белков- проводили в двух пластинах 15Х-НОГО полиакриламиднох о гел (с соотношением мономеров 100:1), размером 120x100x1,5 мм в прерывисто . буферной системе Лэммли, при напря. жении 100Б в течега1е 6 ч.

,

После окончания электрофореза платины гелей пымачивали 2 ч в 0,5 л

0

5

0

5

30

35

40

45

55

50%-ного водного раствора этанола для удаления ЦЦС-Na и переносили в 0,5 л 1%-ной водной суспензии. Кумасси ярко-синего R-250 на 1 ч. Фоновое окрашивание отмывали в двух сменах по 0,5 л 10%-ного водного раствора этанола в течение 2 ч при постоянном покачивании.

Окрашенные зоны белков р35 в случае NP-40 , р35 и р67 в случае 2-меркаптоэтанол-фракции вырезали из геля и тщательно измельчали в фарфоровой ступке. К образцам измель- ,ченного геля добавляли по 30 мп 50%-ного водного раствора этанола, инкубировали смесь в течение 10 мин с перемешиванием для удаления из геля . красителя Частички осаждали центрифугированием взвеси при 10 OOOg .в течение 10 мин при комнатной температуре, К осадкам измельченного геля добавляли по 3 обьема элюирующего буфера (2% JUlC-Na, 5% 2-меркаптоэтано- ла, 0,01 М трис-HCl, рН 9,0), прогревали взвесь в течение 3 мин при 100°С и инкубиров али 48 ч при постоянном перемешивании на качалке при комнатной температуре о

После этого частичкам геля давали свободно осесть в течение 1 ч, надоса- дочную жидкость собирали и диализова- ли против трех смен по 1 л физиологического раствора в течение 24 ч сначала при 20°С, .а затем - при 4°С.

Половину отдиализованного препарата, содержащего элюированный из геля белок, смешивали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда до образования однородной эмульсии и вводили кроликам подкожно в область лопаток. Через 14 дн. вторую половину элюата смешивали с равным объемом неполного адъю- -ванта Фрейнда и повторно подкожно иммунизировали кроликов . Через 7 дн, после второй иммунизации у кроликов забирали кровь из краевой ушной вены И стандартным способом получали из нее сывороткуо

Измельченный полиакриламидный гель с оставшейся в нем после элюации частью белков диализовали против трех смен по 1 л буфера (0,01 М трис-HCl, ,0) в течение 48 ч сначала при , а затем - при 4°С, смешивали его после этого с равным объемом того же буфера и через 14 дн. после второй иммунизагрчи вводили его кроли- -кам подкожно в область лопаток. Через

7 дн, после третьей иммунизации у животных забирали кровь и получали из нее сыворотку.

Активность иммунных сывороток (антисывороток) оценивали методом райиоиммуноанализа с JJ-меченым

белком А из St.aureus на твердом но- cHTe:ie (полистирольные планшеты), В качестве -контроля использовали нормальные сыворотки, полученные от соответствующих животных за 5 дн, до первой и fмyнизaции. Титром антисыворотки считали максимальное ее разведение, при котором п реакции радиоимму- ноанализа наблюдалось еще 2-3-кратное превьш1ение уровня включения J- радиоактивности над уровнем включения контрольной (неиммунной) сыворотки.

Сыворотки, полученные от животных после второй иммунизации только в случае белка р35 из NP-ДО-фракции, показыпали достоверное превышение .над фоном в реакщ и радиоиммуноа-на- лиза в разведении 1/50.

После третьей иммунизации белками в составе измельченного полиакрил- амидного геля титр всех трех пнтисы- вороток резко возрос и составил 1(1000-1)10000, что соответствует титру 1(128-1)256 в реакдаи радиальной иммунодиффузии.

Специфи шость антисывороток прове- ряли методом радиоиммуноблотинга, используя суммарные вирусные белки, разделенные электрофоретически в . 15%-ном полиакриламидном геле, с последующим переносом их на нитроцел- люлозный фильтр и выявлением комплексов антигентантитело J J-меченым белком А из St.aureus авторадиографией .

Для получения моноспецифических антисывороток по предлагаемому спосо- .бу-потребовалось по мкг каждого из индивидуальных белков.

Для получения же моноспецифических антисывороток описанными в лите- ратуре способами требуется более 0,5 кг белка-антигена, при этом аю- тивность получаемых антисывороток значительно ниже активности антисывороток, полученных предлагаемым способом. ПоложительньБ эффект предлагаемого способа по сравнению с прототипом заключается в снижении дозы антигена, необходимого для иммунизации.

более чем п Ю раз при одновременном увеличении тптря антител в целевом

продукте.

Texникo-экoнo ft чp.cкиe преимущества предлагаемого способа заключаются в значительном сокращении объема работ по получению целевого продукта, поскольку для накопления-необходимого для имм низаци количества белка-антигена, во-первых, требуется в 10-20 раз меньше исходного препарата белкоя, ПС-вторых, достаточ- но проведения одного цнкла препара

тивного электрофореза.,

Ilpe naraeNtbiit способ может быть рекомендован для относительно быстрого, простого и эффектипиого получения моноспецифических антисывороток высоким титром против индивидуальных белков-антигенов, рходящмх в состав сложных смосей, при их общем содержании 0,03-0,06 мго

Формула изобретения

Способ получения моноспедифичес- ких антисыпороток путем :)Л Ктрофоре- тиче.ского иыаелс .иия янтигеиа из об- п(ей массы бел коп в виде полоски по- лиакрила№1дного геля, измельчения, иммунизации, жипотных посредством многократного ппедения им noptijn размельченного гчпя, содержапщх днтигйн и адъювант Фрейида, с последующим забором крони у иммунизированных животных, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с ii,ej-(bio повышения активности целерого продукта, с одновременным снижением количества антигена, исполь т зуемого для иммуниза11 1И, после измельчения полоски геля обрабатывают вначале водным раствором этанола, за- тем - трис-НС буферным раствором, рН 9,0, содержащим додецилсульфат натрия, 2-меркаптоэтанол, инкубируют вначале в течение 3 мин при 100 С и

затем - в течение А8 ч при комнатной температуре, суспензию разделяют на элюат, осадок размельченного геля и каждую часть диализуют против физиологического раствора, а иммунизацию животных осуществляют комбинированно путем двукратного введения им элюата в смеси с адъювантом Фрейнда и однократного введения осадка без адъю- ванта.

Изобретение относится к молеку- , лярвой биологии, иммунохимии, медицине- и может быть использовано для эффективной иь1му11иэаг 1и людей и животных, а также для получения высокоактивных моиоспецифических сывороток Цель изобретения - повьппение актив™ ности целевого продукта с одновремен- ним снижением количества антигена} используемого для иммунизации. Для этого моноспецифические антисыноротки получают комбинированной им fyнliзaциeй животных-продуцентов индивидуальными бeлкa fи - антигенами, вьщелепиыми электрофоретически, сначала в растворе в смеси с адч.ювантом Фрейнда, а затем - I) составе измельченного поли- акриламидного геля. Способ позволяет получать высокотитражные антксьгоор зт- ки, исходя и:) л ЬО мкг индивидуального белка-антигена. G ®