СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПРОТЕИНА Российский патент 1994 года по МПК C07K3/02 C07K3/18 C07K13/00 

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для выделения плацентарного протеина свиньи-1 (ППС-1).

В литературе этот белок не описан и способов его получения к настоящему времени в доступной патентной и медицинской литературе не найдено.

ППС-1 был выявлен в экстрактах ткани раннего хориона свиньи со сроком гестации до 8 недель. При иммунохимическом исследовании методом двойной радиальной иммунодиффузии с различными биологическими жидкостями и экстрактами тканей ППС-1 отсутствовал в плазме хряка, супоросной свиньи и эмбриональной сыворотке, а также в экстрактах ткани матки, гипофиза, надпочечника, яичка, яичника, почки, печени, селезенки, легкого. Иммунохимически данный антиген был обнаружен в тканях плаценты на всем протяжении гестации, при этом содержание его в ранней плаценте превышало содержание в терминальной в 4-5 раз. ППС-1 обнаруживался в равных количествах как в материнской, так и в плодной частях плаценты. Содержание его в этих тканях составило около 2 мг на 100 г ткани ранней плаценты.

Полученные данные позволяют пpедположить, что ППС-1 является плацента-специфическим антигеном и может быть использован как маркер для ранней диагностики супоросности свиньи и мониторинга процесса гестации у этого животного. Создание высокочувствительного иммуноферментного метода определения ППС-1 в биологических жидкостях и тканях на основе очищенного препарата этого белка будет способствовать решению этой задачи.

Для получения моноспецифических поликлональных антисывороток к ППС-1 ткань плодной части ранней плаценты свиньи гомогенизировали с равным объемом 0,05 М трис-глицинового буфера, рН 8,5, добавляя 0,1% -ный раствор тритона Х-100, троекратно замораживали и оттаивали, центрифугировали, супернатант диализовали 48 ч против 0,1 М аммоний бикарбонатного буфера и лиофилизировали. Беспородных кроликов-самцов иммунизировали пятикратно, подкожно, вводя каждому животному по 100 мг препарата белков раннего хориона в смеси с полным адъювантом Фрейнда с интервалом в 3 дня. Реиммунизацию проводили тем же количеством препарата без адъюванта на 30-й день после последней иммунизации. Полученные антисыворотки абсорбировали плазмой хряка, экстрактами почки, печени и селезенки. С помощью эти антисывороток в ткани ранней плаценты свиньи был идентифицирован антиген с подвижностью альфа_о-глобулина в агаровом геле.

Целью изобретения является получение очищенного препарата плацентарного протеина свиньи-1, достигаемое следующим образом: плодную часть 8-недельной плаценты свиньи гомогенизируют с равным количеством 0,01 М трис-НСl буфера, рН 7,5-8,5, гомогенат центрифугируют после троекратного замораживания и оттаивания, супернатант используют в аффинной хроматографии на иммобилизованном гексаметилендиамине, связавшиеся белки элюируют 2,0-4,0 М раствором хлорида натрия с добавлением 1% глицина, элюат осаждают при 90% насыщения сульфатом аммония, центрифугируют и осадок фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в 0,1 М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,15, фракции, содержащие целевой продукт, собирают и лиофилизируют, получая препарат ППС-1 50% -ной степени чистоты.

Сорбент синтезировали следующим образом. 100 мл сефарозы 6В отмывали на фильтре 1 л дистиллированной воды, слегка отжимали, переносили в химический стакан, заливали 100 мл ацетона, добавляли 1,5 г трихлортриазина, тщательно перемешивали, ставили на магнитную мешалку и при медленном перемешивании добавляли по каплям 10% -ный раствор едкого натра, доводя рН до 8,5, после чего прекращали добавление едкого натра, выжидали 5 мин и прекращали реакцию, добавляя к смеси 50 мл 50% уксусной кислоты. Полученную проектированную сефарозу отмывали на фильтре от несвязавшегося трихлортриазина и продуктов реакции 1 л 50% -ного водного раствора ацетона и дополнительно 1 л дистиллированной воды; далее сефарозу переносили в химический стакан, добавляли 100 мл дистиллированной воды и 2 г гексаметилендиамина, ставили на магнитную мешалку на ночь при медленном перемешивании. На следующий день полученный сорбент отмывали 3 л дистиллированной воды на фильтре, после чего сорбент гексаметилендиаминсефароза был готов к употреблению.

Новым в предлагаемом способе является то, что для выделения и очистки из сложной белковой смеси ранее неизвестного белка - плацентарного протеина свиньи использован биоспецифический для данного белка лиганд - гексаметилендиамин, иммобилизованный на нерастворимой матрице - сефарозе, причем элюат, содержащий ППС-1, фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в летучем буфере, решая тем самым одновременно две задачи: дополнительной очистки и диализа. Кроме того, обработка исходного материала буфером с низкой ионной силой позволяет избежать диализа приготовляемой белковой смеси и использовать супернатант гомогената сразу в аффинной хроматографии.

Для достижения цели изобретения выбраны и обоснованы параметрические значения способа. Так, при обработке ткани плаценты объемом буфера более однократного наблюдалось разведение белковой смеси и меньшая сорбция ППС-1 на сорбенте; при обработке ткани плаценты объемом буфера менее однократного ионная сила приготовляемой белковой смеси была более 0,08, что препятствовало сорбции искомого белка на лиганде.

Для аффинной хроматографии ППС-1 на иммобилизованном гексаметилендиамине оптимальным значением рН для наилучшей сорбции белка было 7,5-8,5 и молярность трис-НСl буфера 0,06-0,08; при уменьшении минимального значения ниже 7,5 наблюдалось уменьшение количества сорбируемого белка, при увеличении рН более максимального 8,5 количество сорбируемого белка отвечало оптимальному значению, однако при этом увеличивалась сорбция балластных белков, что приводило к уменьшению чистоты препарата. Изменение молярности трис-НСl буфера более 0,08 приводило к уменьшению сорбции белка на сорбенте и снижению выхода целевого продукта; при молярности менее 0,06 наблюдалась дополнительная сорбция балластных белков и соответствующее этому уменьшение чистоты препарата. Добавление глицина в элюирующий буфер позволяло добиться более полной десорбции ППС-1. Оптимальным значением молярности элюирующего буфера была величина 2,0-4,0 М.

П р и м е р 1. 100 г ткани 8-недельной плаценты свиньи (плодная часть) гомогенизируют со 100 мл 0,01 М трис-НСl буфера рН 7,5, трижды замораживают и оттаивают, центрифугируют 45 мин при 6000 об/мин. Супернатант используют в аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным гексаметилендиамином в 0,06 М трис-НСl буфере рН 7,5. Связавшиеся белки элюируют 2,0 М раствором хлорида натрия с 1% глицина, элюат осаждают при 90% насыщения сульфатом аммония 12 ч при 4^оС и центрифугируют 45 мин. 8000 об/мин. Осадок фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в 0,1 М аммоний-бикарбонатном буфере, рН 8,15, фракции содержащие ППС-1, собирают и лифилизируют, получая 0,4 мг белка. Содержание ППС-1 40% , выход 8% .

П р и м е р 2. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,08 М трис-НСl буфере рН 8,5. Связавшиеся белки элюируют 4,0 М хлоридом натрия с добавлением 1% глицина. Дальнейшие процедуры - как в примере 1. Получюат 0,6 мг белка. Содержание ППС-1 30% , выход 9% .

П р и м е р 3. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,07 М трис-НСl буфере рН 8,0. Связавшиеся белки элюируют 3,0 М хлоридом натрия в смеси с 1% глицином. Дальнейшие процедуры как в примере 1. Получают 0,54 мг белка. Содержание ППС-1 50% , выход 13,5% .

Предлагаемый способ является оригинальным способом выделения нового белка - плацентарного протеина свиньи-1.

При изучении физико-химических свойств ППС-1 было установлено, что данный белок обладает электрофоретической подвижностью (относительно альбумина) - 1,0, молекулярной массой, определенной в гель-фильтрации около 90 кД. Белок содержит углеводы при окрашивании дуги преципитации по методу Шиффа и осаждается сульфатом аммония при 60% насыщения.

Данные иммунохимического анализа и физико-химические свойства ППС-1 позволяют считать, что этот белок неидентичен альфа-фетопротеину свиньи, обнаруженному в больших количествах в эмбриональной сыворотке; ППС-1 отличается и от плацентарного лактогена свиньи, имеющего молекулярную массу около 20 кД; от трофобластического протеина свиньи, также имеющего молекулярную массу около 20 кД.

Разработка оригинального способа выделения ППС-1 и получение к нему антисыворотки является актуальной научной задачей, поскольку данный белок выявлен в ткани ранней плаценты и разработка высокочувствительного иммуноферментного метода определения ППС-1 позволит получить тест для ранней диагностики супоросности и ее течения. (56) ЕР N 0206181, кл. С 07 К 13/00, С 12 N 15/06, 1987.

Использование: сельскохозяйственная биотехнология, экспериментальная ветеринария. Сущность применения: проводят фракционирование супернатанта гомогената белков раннего хориона свиньи на иммобилизованном гексаметилендиамина с последующей гель-фильтрацией элюата на сефадексе G-200.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПРОТЕИНА, включающий получение гомогената ткани, центрифугирование, хроматографирование с последующим элюированием, отличающийся тем, что из тканей используют ткань ранней плаценты свиньи, из хроматографий используют аффинную хроматографию на сефарозе с иммобилизованным гексаметилендиамином в 0,06 - 0,08 М трис-HCI-буфере рН 7,5 - 8,5, элюирование проводят 2,0 - 4,0 М раствором хлорида натрия с добавлением 1% глицина, дополнительно элюат осаждают при 90% -ном насыщении сульфатом аммония, центрифугируют и осадок фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в 0,1 М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,15, фракции, содержащие целевой продукт, собирают и диализуют.