Способ определения фибринолитической активности плазмы крови Советский патент 1990 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к биохи.чии и физиологии свертывания крови, в частности к клинико-лабораторной диагностики при исс ледовании действия антикоагулянтов и фибринолитиков на процесс фибринолиза, и может быть использовано в патофизиологии и меДй цине при диагностике состояний, связанных:, с патологией системы гемостаза и их лечении.

Целью изобретения является повышение точности способа за счет определения суммарного фибринолиза, а также

возможности определения степени полимеризации фибрина.

Способ осуществляют следующим образом

Берут испытуемую плазму крови и определяют в ней фотометрически концентрацию фибриногена, после чего плазму смешивают с 0,3-0,4%-ным раствором фибрин-мономера в соотношении 1:1-1:1,5, к смеси добавляют буфер Палитча с рН 7,6-7,7 в соотношении 1:3-1:4, инкубируют 60-70 мин при 37-37,, после чего отделяют жидкую

фазу от сгустка, который затем гидролизуют в 2 gI 0,1 N при кипячении и определяют количество полимвризованного белка. О степени лизиса нестабилизированного фибрина судят по снижению количества полимеризованного балка в сгустке после инкубации пробы по сравнению с исходным количеством белка, включающим концентрацию фибриногена в испытуемой плазме и количество фибрин-мономера, полимеризованного в пробе в отсутствие плазмы О степени полимеризации нестабилизированного фибрина судят по нарастанию количества полимеризованного белка по сравнению с исходным

Изобретение дает возможность определять в разных типах плазм нормальной, плазме от больных, плазме после введения фибринолитически агентов как степень повышения полимеризации нестабилизированного фибрина, так и степень лизиса, в то время как с помощью прототипа можно определять в разных образцах плазм лишь степень лизиса нестабилизированного фибрина, а также определять суммарный лизис нестабилизированного фибрина под действием как ферментативных, так и неферментативных агентов

П р и м е р 1 о Берут цитратную плазму здорового животного (крысы 0 В коническую пробирку объемом 10 мл отбирают 0,2 мл плазмы для определения концентрации фибриногена В химическую пробирку объемом 20 мл вносят 0,1 мл 0,3%-ного раствора фибрин-мономера, добавляют 0,09 мл испытуемой плазмы и 0,8 мл буфера Йалитча с рН 7,6 В контрольную пробирку берут 0,1 мл раствора 0,3%-ного фибринмономера и.О,4 мл буфера Палитча Пробы ставят инкубировать при 37,0°С на 60 мин, после чего в них отделяют жидкую фазу от сгустка, пробирки со сгустком ополаскивают физиологическим раствором хлорида натрия, опрокидывают вверх дном, подсушивают фильтровальной бумагой. Затем в пробирки добавляют по 2 МП 0,1 N NaOH и гидролизуют при li кипячении После охлаждения в пробах фотометрически с реактивом Фолин-Чикалто определяют количество полимеризованного белка, а. в конической пробирке, содержащей одну плазму, производят определение концентрации фибриногена по методу ВидвелЛо Получают; А - количество полимеризованного белка в иссследуемой плазме - 550 мг%;- В - концентрация .фибриногена в исследуемой плазме 480 мг%; С - количество полимеризованного фибран-мономера в пробе без плазмы - 135 Mr%V

Так как количество полимеризованного белка в пробе с плазмой (А) после инкубации меньше, чем исходное количество белка в этой пробе (фибриноген + фибрин-мономер или В+С), то рассчитываем степень лизиса по формуле

(В+С)-А

или

(480+135)-550 ,-- 6500 480+135 grr-

10,6% лизисас

Таким образом в крови здорового животного отмечена слабая степень лизиса

Пример 2о Берут цитратную плазму больного Х, до лечения (ожог с поражением 15% поверхности тела, шок )с В коническую пробирку отбирают 0,2 мл исследуемой плазмы, для определения концентрации фибриногена. В химическую пробирку берут 0,15 мл 0,4 0,4%-ного раствора фибрин-мономева, добавляют 0,11 мл исследуемой плазмы и 1,0 мл буфера Палитча с рН 7,7 В контрольную пробирку берут 0,15 мл 0,4%-ного раствора фибрин-мономера и 1,0 мл буфера Палитча Пробирки инкубируют при 37, в течение 70 мин После инкубации в пробирках отделяют ЖИДКУЮ фазу от сгустка, который после промывки физиологическим раствором гидролизуют как и в приме- , ре 1.Затем в пробах фотометрически определяют количество полимеризованного белка, а в пробирке, содержащей одну плазму, проводят определение концентрации фибриногена Получают; А количество полимеризованного белка в пробе с плазмой - 1050 мг%, В - концентрация фибриногена в плазме 405 мг%; С - количество полимеризованного белка в пробе без плазмы 250 мг%„

Так как количество полимеризованного белка в пробе с плазмой 10 (1050 мг%) превышает количество исходного белка (фибриноген+фибрин-моioMep или 405+260 655 мг%), то рассчитываем степень полимеризации нестабИлизированного фибрина в исследуемой пробе по формуле А В+С Получают йоЧч-ЙО полимеризации о Таким образом в плазме больного отмечается высокая степень полимеризации нестабилизированного фибрина (и, следовательно, отсутствие лизиса) , что свидетельствует о склонности к тромбообразованию П р и м е р Зо Берут цитратную плазму больного N до лечения (ожог 10% поверхности тела, шок):. В коническую пробирку отбирают 0,2 мл плаз мы для определения фибриногена, В хи мическую пробирку берут 0,1 мл определяемой плазмы и добавляют 0,15 мл 0,3%-ного раствора фибрин-мономера и 0,8 МП буфера Палитча с рН 7,65 В контрольную пробирку берут 0,15 мл 0,35%-ного раствора фибрин-мономера и 0,5 мл буфера Палитча, Пробы инкуб руют при 37, 65 .мин, после чего в них отделяют жидкую фазу от сгустка и далее поступают как в примерах 1 и 2, После фотометрирования получают А - количество полимеризованного бел ка в пробе с плазмой - 1060 мг%; В - концентрация фибриногена в испытуемой плазме - 605 мг%; С - количество полимеризованного белка в пробе без плазмы - 160 мг%, Так как количество полимеризованного брлка в испытуемой пробе (А) превьгаает исходное количество белка (фибриноген + фибрин - мономер), то рассчитывают процент полимеризации нестабилизированного фибрина в пробе по формуле, как и в примере 2: ,5% п или 605-И60 лимеризации. Таким образом в плазме больного отмечается высокая степень полимеризации нестабилизированного фибрина, Следовательно, в плазме больного име ется тенденция к тром5ообразованию П р и м е р 4о Берут цитратную плазму того же больного N. после про ведения противотромботической тера пии: однократно гепарин в дозе tOOOO ИЕ и затем на фоне гепаринизадни по 2500 ИЕ шестикратно в течение сутоко Все объемы реагентов и операц такие же, как и в примере 3. После фотометрирования получают: А - количество полимеризованного белка в пробе с плазмой - 580 мг%; В - концентрация фибриногена в испытуемой плазме - 720 мг%; С - количество полимеризованного белка в пробе без плазъы - 160 мг%, Так как количество полимеризованного белка в испытуемой пробе ниже, чем исходное количество белка, подвергающееся полимеризации (фибриноген + фибрин-мономер ), то рассчитывают степень лизиса нестабилизированного фибрина по формуле, как в примере 1: (В+С)-А (В+С) получая (720+160)-580 лизиса. (7204-160) Таким образом гепаринизация больного оказывает положительное влияние на гемостаз - вызывает лизис нестабилизированного фибрина и, следовательно, снижает степень риска тромбообразования„Использование испытуемой плазмы без смешивания с р-аминокапроновой кислотой позволяет определять суммарный лизис при действии как ферментативных, так и неферментативных фибринолитиков и других агентов, Тое, расширяет спектр применяемых лизирующих агентов. В прототипе определяют степень лизиса за счет лишь фибринолитников неферментативной природы; кроме степени лизиса предлагаемый метод позволяет определить степень полимеризации нестабилизированного фибрина; метод позволяет диагностировать в плазме больных повьппенную степень тромбоопасности по увеличению полимеризации нестабилизированного фибрина; метод позволяет судить об адекватности дозировок применяемых терапевтических агентов с целью снижения риска тромбообразования, Формула изобретения Способ определения фибринолитической активности плазмы крови путем получения полимеризованного фибринмономера, обработки его исследуемой плазмой, инкубации с последующей фотометрической регистрацией количества полимеризованного белка в смеси, и . расчетом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, за счет определения суммарного фибрий(:иш за,: а.также возможности одновременного ояределения степени попнмеризацнн фибрина, предварительно в плазме определяют концентрацию фнбриногена, а пояимеризованный фибрннMOHOMei получшот путем одновременного 159 48 смешивания фибрнн-мономера, буфера Палитча и плазмы, при этом в первона.чально полученную смесь, содержащую 0,09-0,11 МП плазмы и 0,09-0,135 мл 0,3-0,4%-ного раствора фибрин-мономера, добавляют буфер Палитча в объемном соотношении 1 3-1:4„

Изобретение относится к области физиологии и биохимии свертывания крови и может быть использовано в патофизиологии и в клинико-лабораторной практике, для определения степени полимеризации и лизиса нестабилизированного фибрина в плазме. Целью изобретения является повышение точности способа за счет определения суммарного фибринолиза, а также возможности одновременного определения степени полимеризации фибрина. Для этого в плазме крови определяют концентрацию фибриногена, после чего плазму смешивают с 0,3-0,4%-ным раствором фибрин-мономера в соотношении 1:1-1:1,5 к смеси добавляют буфер Палитча с PH 7,6-7,7 в соотношении 1:3-1:4 и инкубируют при 37-37,5°С в течение 60-70 мин, после чего отделяют жидкую фазу от сгустка, который затем гидролизуют щелочью при кипячении и фотометрируют с реактивом Фолин-чикалто. О лизисе нестабилизированного фибрина судят по убыванию количества полимеризованного белка в сгустке, включающем концентрацию фибриногена и фибрин-мономера, а по нарастанию его - о степени полимеризации. Способ можно использовать для диагностики предтромботических состояний и оценки эффективности используемых агентов при их лечении.