Способ культивирования штамма-продуцента вируса иммунодефицита человека I типа Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии, может быть использовано при производстве диагностических и профилактических вирусных препаратов.

Целью изобретения является удешевление способа.

При культивировании штамма - продуцента вируса иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-1) в качестве необходимого компонента питательной сре- ды используют сыворотку крупного рогатого скота (КРС), обработанную полиэтиленгликолем мол. массой 6000 (конечная концентрация 8-9%), с дополнительным многократным замораживанием - оттаиванием сыворотки.

Физико-химические и биохимические показатели сывороток представлены в табл. 1.

Данные табл. 1, представленные по результатам не менее пяти экспериментов, показывают, что очищенная сыворотка не содержит v-глобулиновой фракции и по ряду показателей приближена к сыворотке крови плодов коровы.

Влияние питательной среды, содержащей очищенную сыворотку КРС, на вирус- продукцию культуры клеток, хронически инфицированных ВИЧ-1, представлено в табл. 2 (по результатам 5 серий).

Результаты табл. 2 показывают, что использование предлагаемой среды, содержащей очищенную сыворотку крови КРС, не приводит к изменениям парасд

со |

со эо эо

метров культуры клеток по сравнению со средой известного способа, содержащей сыворотку крови плодов коровы Flow. На протяжении 24 пассажей уровень вируспродукции клеток на питательных средах с очищенной сывороткой КРС остается на том же уровне, 1что и на средах, содержащих контроль ную сыворотку.

I Способ культивирования моноцитар- |ной линии клеток - продуцентов ВИЧ-1 с использованием предлагаемой питательной среды отработан в лабораторных условиях на роллерной установке в роллерно-суспензионном режиме (объем 30 л).

Пример 1. Очистка сыворотки КРС.

Кровь КРС собирают в убойном цехе Коагулированную кровь отстаивают при А С V течение 48 ч для оптимального сбора сыворотки. К 20 л сыворотки, отделенной от сгустка крови, медленно с перемешиванием добавляют 40%-ны водный раствор полиэтиленгликоля мол массой 6000 до конечной концентрации 8%. Затем смесь отстаивают при в течение 17-20 ч. Супернатант собирают в стеклянные бутьти емкостью 0,5 л и замораживают. После замораживания сыворотку оттаивают и вновь подвергают замораживанию. Цикл замораживание - оттаивание повторяют 4 раза, сыворотку отфильтровывают через ватно-марлевьш фильтр, анализируют на фракционный состав (табл. 1) и подвергают стерилизующей фильтраци через мембранные фильтры с диаметром rfop 0,22 мкм. Очищенную таким образом сыворотку используют для культивирования клеток - продуцентов ВИЧ-1.

Пример 2. Очистку сыворотки КРС проводят аналогично примеру 1, но к сыворотке добавляют полиэтилен- гликоль до конечной концентрации 9%, а цикл замораживания - оттаивания повторяют 3 раза.

Пример 3.. Культивирование клеток - продуцентов ВИЧ-1.

Во флакон со средой RPMI-1640 ,стерильно по.сле добавления антибио- тикрв (гентамицин 160 мкг/мл и лин- комицин в конечной концентрации 0,06%) и глютамина до конечной концентрации 0,03% вводят очищенную сы воротку КРС в следующем объемном

5

0

5

0

5

0

5

0

5

отношении компонентов, %: среда 85; сыворотка 15.

Культивирование моноцитарной линии клеток - продуцентов ВИЧ-1 проводят при посевной концентрации 8 х к 10 кл/мл в роллерных пластиковых бутылях объемом 2 л при соотношении жидкой и газовой фаз 1:5 соответственно, частоте вращения роллера 1 - 2 об/мин и температуре 36,5iO,5°C.

При пересеве клеток - продуцентов. ВИЧ-1 через 4-6 сут инкубации полови- ну объема суспензии клеток сливают для дальнейшего использования, добавляют такой же объем свежей питательной среды роста и инкубируют в тех же условиях.

Вьпсод вируссодержащей культураль- ной жидкости с одной роллерной установки (76 роллерных бутылей) за один пассаж составляет 15л. Урожай собирают на протяжении 24 пассажей.

Пример 4. Культивирование клеток проводят аналогично примеру 3, но используют питательную среду, содержащую 15 об.% сыворотки крови плодов коровы Flow. Результаты вируспродукции клеток представлены в табл. 2.

Пример 5. Культивирование клеток - продуцентов ВИЧ-1.

Культивирование клеток проводят аналогично примеру 3, но используют питательную среду, содержащую 7,5 об.% очищенной сыворотки КРС и 7,5 об.% сыворотки крови плодов коровы Flow. Результаты вируспродукции клеток на питательной среде с частичной заменой сыворотки крови коровы по сравнению с известным спЬ- собом (табл. 2): морфология клеток нормальная; индекс пролиферации 2,1010,18; доля живых клеток 69,4t ±0,05; доля ВПК по НИФ 4-40,%; титр ИФА 1/(64i17), показывают, что использование среды с частичной заме- ной сыворотки Flow не приводит к изменениям параметров культуры клеток.

Пример 6. Культивирование клеток проводят аналогично примеру 3, но питательная среда содержит 15об.% сыворотки КРС. Результаты использования такой питательной среды отрицательны. Роста клеток - продуцентов ВИЧ-1 не наблюдают.

Формула изобретения

Способ культивирования штамма - продуцента вируса иммунодефицита человека I типа на стандартной пита- -тельной среде с добавлением сыворотки крови, отличающийся I

тем, что, с целью удешевления способа, из сывороток используют сьгооротку крупного рогатого скота, которую перед употреблением обрабатывают 8-9%-ным полизтиленгликолем мол. массой 6000 и подвергают 3-4-кратному замораживанию - оттаиванию.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии и может быть использовано при производстве диагностических и профилактических вирусных препаратов. Целью изобретения является удешевление способа. Способ заключается в том, что для культивирования клеточной линии, продуцирующей ВИЧ-1, используют питательную среду, содержащую в качестве добавки, стимулирующей рост клеток, сыворотку крупного рогатого скота, обаботанную полиэтиленгликолем и дополнительно подвергнутую замораживанию-оттаиванию. Способ позволяет получить 15 л культуральной жидкости за 1 пассаж при роллерно-суспензионном культивировании. Способ может быть использован для производства диагностических препаратов ВИЧ-1. 2 табл.

Показатели

КРС

0,39tO,08 74,80 is, 60

35,50 ±5,10 12,70 t2,20 12,40±3,40 32,40 -3,20

0,1610,02 30,00114,00

72,23+1,77 16,,35 11,49±3,12 Отсутствует

0,1910,03 36,00t3,10

56,7014,50 30,8С±3,60 12,50+2,80 Отсутствует

Прозрачность, ед. опт.плот. Общий белок, г л фракционный состав белков, 7,

альбумин

«/-глобулин

уЭ -глобулин .у-глобулин Остаточньй гемоглобин, г-л- 0,56+0,140,,060,37tO,03

Сыворотку КРС обрабатывают 8 -9%-ным прлиэтиленгликолем с 3-4-кратным замораживанием - оттаиванием.

Таблица 2

Среда Содержание Морфоло- Индекс Доля живых Доля ВПК, Титр ИФА сыворотки, гия кле- проли- клеток, % % по НИФ % ток ферации

Предла-Нормальгаемая15 ная 2,22tO,47 71,,06 10-30 1/(91432) Известная15 Тоже 2,11±0,,8±0,04 10-30 1/(lOOi-34)

Примечание. ВПК - вируспродуцирующие клетки; НИФ - непрямая

иммунофлуоресценция; ИФА - иммунофлуоресцентный анализ.

Составитель И.Тареева Редактор И.Дербак Техред М.Дидык Корректор Л.Пилипенко

-- --- ----- ---- ---i-i---..«..- ««.

Заказ 3032Тираж 486Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Сыворотка

Очищенная сыворотка КРС

Плод коровы

0,1610,02 30,00114,00

0,1910,03 36,00t3,10

56,7014,50 30,8С±3,60 12,50+2,80 Отсутствует

0,37tO,03