ШТАММ ПЕРЕВИВАЕМОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ПОЧКИ КОШКИ ПК-91 ДЛЯ РЕПРОДУКЦИИ ПАРВОВИРУСОВ ПЛОТОЯДНЫХ Российский патент 1998 года по МПК C12N5/06 

Изобретение относится к области общей и прикладной вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей для наработки и изучения вирусов, а также с целью производства противовирусных вакцин.

Известна первичная культура клеток из почки кошки для репродукции парвовирусов плотоядных с целью производства вакцин против парвовирусного энтерита норок на биофабриках России. Данная культура клеток обладает достаточной чувствительностью к парвовирусам плотоядных, обеспечивает выход вируса энтерита плотоядных в титрах реакции гемагглютинации от 1:64 до 1:256, а в отдельных случаях 1:512 - 1:1024.

Однако первичная культура клеток почки кошки при ее использовании для репродукции вирусов имеет ряд недостатков: низкий титр получаемого вируса; необходимость в значительном количестве материала для трипсинизации (постоянный поиск кошек определенного возраста) с целью получения нужных клеток; постоянный контроль на чувствительность и качество получаемых клеток вследствие нестандартности используемого материала; многостадийность процесса получения вируса (трипсинизация, центрифугирование, посев клеток на монослой, инфицирование монослоя, смена среды и т.д.); большой процент брака по стерильности вследствие многостадийности указанной технологии получения вируса; использование в технологии культивирования сыворотки крупного рогатого скота требует проверки этой сыворотки на антивирусную активность.

Перевиваемые культуры клеток выгодно отличаются от первичных культур возможностью работать в стандартных условиях, иметь эталонные производственные заморозки культур клеток, иметь стабильные параметры роста культуры клеток и, как следствие, стабильные результаты при наработке и выделении вируса с более высоким титром.

Известны две перевиваемые клеточные культуры, полученные из почек кошки C₈₁ и F₈₁ для производства вакцин против парвовирусного энтерита норок, в частности для профилактики парвовирусных энтеритов у редких животных (куниц, лисиц, военно-полицейских собак, персидских кошек, тигров, енотов ("Чжунго Кэсюз - Наука Китая". - 1990, с. 399-408). Для культивирования вирусов на указанных культурах клеток используется ростовая среда Игла МЕМ с 10%-ной телячьей сывороткой. Поддерживающая среда содержит (1-4)% телячьей сыворотки. Выход вируса в среднем составляет в реакции гемагглютинации 1:64 - 1: 8192. На клетках успешно культивировались следующие вирусы: парвовирусный энтерит норок (MEV), панлейкемия кошек (FPLV) и собачий парвовирус (CPV).

Недостатком данной перевиваемой клеточной культуры является высокая стоимость компонентов питательной среды, в частности телечьей сыворотки, а также недостаточно высокие средние титры получаемых вирусов.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является перевиваемая культура клеток почки кошки CRFK (Crandell Feline Kidney cell Line), полученная в США и используемая для производства вакцин против парвовирусного энтерита норок (United Vaccines. U.S. Vet. Lic., N 245. - 1990. - p.p. 2-7). Для культивирования вируса используется ростовая и поддерживающая среда Игла MEM с (4-10)%-ной бычьей сывороткой. Культура клеток CRFK обеспечивает выход вируса в титрах реакции гемагглютинации от 1:128 до 1:1024.

Недостатком перевиваемой культуры клеток почки кошки CRFK является недостаточный выход вируса (низкий титр) вследствие ограниченных возможностей указанной культуры клеток и используемой технологии культивирования, кроме того, применение бычьей сыворотки требует проверки на антивирусную активность, а использование Hepes буфера в поддерживающей среде приводит к удорожанию технологии получения вируса.

Задачей предлагаемого технического решения является создание нового стабильного отечественного штамма перевиваемой культуры клеток почки кошки, культивируемого на доступных питательных средах и обеспечивающего репродукцию парвовирусов плотоядных в высоких титрах (для MEV - штаммы "Родники", "Береговой" от 1:4096 до 1:32768 в реакции гемагглютинации, а для CPV - 1: 256).

Поставленная задача решается тем, что получен новый штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки ПК-91 (FK-91 Feline Kidney). Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) под номером 49.

Штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки ПК-91 получают из кортикальной части почек домашней кошки (4-5 месячного возраста). После первичной 3-кратной трипсинизации и общего сбора клеток по общепринятой методике получения первичных культур клеток (В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. Ветеринарная вирусология. - М. : Колос, 1984, с. 372) в количестве 7•10⁶ клеток, Оставшиеся кусочки почек были залиты раствором следующего состава: 1 часть 0,02% версена, 1 часть 0,3% трипсина, 1 часть среды 199 и оставлены при температуре +4⁺2^oC на трое суток. Через трое суток кусочки были разбиты (встряхиванием), профильтрованы через 4-слойную марлевую салфетку. Клеточная суспензия отцентрифугирована при 1000 об/мин в течение 10 минут, осадок ресуспендирован в 200 мл ростовой среды: Игла MEM с 10%сыворотки крупного рогатого скота (КРС) и антибиотиками (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 0,1 мг/мл). Готовая суспензия была высажена в 1,5 литровый матрас и помещена в термостат при температуре (36,5⁺0,5)^oC, через сутки смена ростовой среды. Через 18 суток вновь смена ростовой среды и еще через шесть суток смена указанной среды на Игла MEM с 10% эмбриональной сыворотки. Через 5 суток (30 суток с начала проведения работ) первый пассаж - рассев 1:2. Второй пассаж через трое суток - рассев 1:2,5. До 8 пассажа используется ростовая среда Игла MEM с 10% эмбриональной сыворотки. С 9 по 11 пассажи - среда Игла MEM с 5% сыворотки КРС и 5% эмбриональной сыворотки. С 12 по 24 пассажи использовалась среда Игла MEM с 8% сыворотки КРС и 2% эмбриональной сыворотки. С 25 по 27 пассажи - среда Игла MEM с 9% сыворотки КРС и 1% эмбриональной сыворотки. С 28 по 30 пассажи - среда Игла MEM с 10% сыворотки КРС. С 31 по 38 пассажи среда Игла MEM с 4% сыворотки КРС, обработанной (ПЭГ) полиэтиленгликолем (Игудин Л.И., Орлов С.Д., Шалунова Н.В. Способ очистки крови крупного рогатого скота. - Вопросы вирусологии, 1990, N 5. - с. 540) и 1% эмбриональной сыворотки. С 39 пассажа использовалась ростовая среда Игла MEM с 4,5% сыворотки КРС, обработанной ПЭГ и 0,5% эмбриональной сыворотки. Эталонное замораживание клеток произведено на 57 пассаже.

К моменту паспартизации штамм ПК-91 прошел 70 пассажей, к моменту депонирования - 180 пассажей.

Морфологическая характеристика клеток штамма ПК-91. Клетки полиморфные. Ядра овальные различной величины. Ядрышки крупные, от одного до четырех в ядре.

Контроль контаминации. По данным электронно-микроскопического анализа и микробиологического контроля путем высева на набор селективных сред было выяснено, что клетки штамма ПК-91 свободны от вирусной, микоплазменной, грибковой и бактериальной контаминации.

Кариологическая характеристика. По результатам кариологического анализа клеток штамма ПК-91 определены следующие его свойства:
1. Видовая принадлежность. Анализ проведен на метафазных хромосомах, окрашенных по G-методу. Кариограммы хромосом составлены в соответствии с номенклатурой, предложенной Варстер-Хилл и Грей (Wurster-Hill, Gray, Cytogenet. Cell Genet. 12, 377-397, 1973). Установлено: кариотип соответствует виду - Felis catus.

2. Плоидность кариотипа. Проанализировано 1000 клеток на препаратах, приготовленных без выжигания фиксатора на стекле и окрашенных азуром-зозином. Полиплоидные клетки (число хромосом больше 100) составляет 2%.

3. Распределение клеток по числу хромосом. Проанализировано 100 клеток на препаратах, приготовленных без выжигания фиксатора на стекле и окрашенных азуром-эозином.

Микрофотография метафазной пластинки клеток штамма ПК-91.

2n-38; модальный класс - 64 хромосомы

4. Наличие маркерных хромосом. Имеется 3 маркерных хромосомы: M1 - B3p⁺; M2 - C2p⁺; M3 - i(D1q).

Стандартные условия выращивания. Для выращивания культуры клеток ПК-91 используют ростовую среду Игла MEM с 4,5% сыворотки КРС, обработанной ПЭГ и 0,5% эмбриональной сыворотки плодов коровы. В качестве антибиотиков используют пенициллин - 100 ед/мл и стрептомицин - 0,1 мг/мл. Температура выращивания: (36,5⁺0,5)^oC.

Культуральные свойства. Клетки ПК-91 культивируют в монослое (в стационарных условиях или во вращающихся флаконах). Посевная доза составляет 40-80 тыс. клеток в 1 мл. Кратность рассева: 1:4 - 1:8. Клетки пассируют с частотой 3-4 суток. Для снятия клеток с монослоя используют 0,02% раствор версена (9/10) и 0,125% раствор трипсина (1/10).

Способ криоконсервации. Для криоконсервации клеток используется среда: Игла MEM - 60%, сыворотка эмбриональная плодов коровы - 30%, глицерин - 10% или ДМСО - 7,5%. Режим замораживания клеток осуществляют путем понижения температуры на 1^oC в минуту до -40^oC с последующим их помещением в жидкий азот. Для длительного хранения клеток в жидком азоте при температуре 196^oC используют криопробирки или криоконтейнеры.

Режим оттаивания. Ампулу (контейнер) помещают в воду, подогретую до 37^oC, при постоянном перемешивании. После оттаивания содержимого ампулы ее вскрывают в стерильных условиях. Содержимое ампулы помещают в центрифужный стакан, добавляют ростовой среды 5 частей, центрифугируют при 1000 об/мин 10 минут. Надосадочную жидкость выливают, осадок ресуспендируют в ростовой среде до посадочной концентрации и высевают на матрас (роллер) и помещают в термостат с температурой (36,5⁺0,5)^oC до образования монослоя. Перед высевом на матрас берут пробу (0,5 мл) и смешивают 1:1 с 0,2% раствором трипанового синего. Подсчет % жизнеспособных клеток ведут в камере Горяева


где
N - общее количество клеток;
n - количество живых клеток;
m - количество мертвых клеток.

Характеристика вируспродукции. Культура клеток ПК-91 обеспечивает выход парвовирусного энтерита норок при титровании по реакции гемагглютинации (РГА) от 1:4096 до 1:32768, а собачьего парвовируса - 1:256. Штамм сохраняет свои свойства по вируспродукции до 180 пассажа (время наблюдения). Тенденции к снижению вируспродукции нет.

Пример 1. Подготовка культуры клеток ПК-91 для репродукции парвовирусов плотоядных.

Чистую культуру клеток ПК-91, хранящуюся в виде производственных заморозок в жидком азоте, оттаивают, добавляют ростовой среды Игла MEM с 4,5% сыворотки КРС, обработанной ПЭГ, 0,5% эмбриональной сыворотки плодов коровы, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 0,1 мг/мл. Смесь центрифугируют при 1000 об/мин 10 минут. Надосадочную жидкость выливают, осадок ресуспендируют в ростовой среде до посадочной концентрации.

Культуру клеток ПК-91 (FK-91) выращивают на 1,5 литровых матрасах. Посадочная концентрация клеток 0,04•10⁶ кл/мл, по 250 мл ростовой среды на 1 матрас. Матрасы с клетками помещают в термостат с температурой (36,5⁺0,5)^oC. Монослой клеток образуется на 3-4 сутки. После образования монослоя клеток ростовая среда сливается, монослой ополаскивается раствором для снятия клеток (0,02% раствор версена - 9/10 и 0,125% раствор трипсина - 1/10). При этом клетки отслаиваются от стекла и ресуспендируются в ростовой среде до концентрации (0,4-0,7)•10⁶ кл/мл. Часть клеток доводится ростовой средой до посадочной концентрации и рассевается на новые матрасы (чистые клетки). Остальная часть клеток используется для инфицирования парвовирусов плотоядных.

Пример 2. Получение антигена парвовирусного энтерита норок (MEV) на культуре клеток почки кошки ПК-91.

В 400 мл суспензии клеток в концентрации 0,5•10⁶ кл/мл общее количество клеток составляет 200 миллионов, что достаточно для приготовления 20 матрасов. В указанный объем суспензии клеток в концентрации 0,5•10⁶ кл/мл вводят 3 мл посевного вирусного материала шт. "Родники" или "Береговой" (получен на животных) с титром по РГА 2¹⁸ (1:262144) и суспензию помещают в холодильник с температурой (+4⁺2)^oC. По истечению 1 часа клеточную инфицированную суспензию извлекают из холодильника и разводят поддерживающей средой (Игла MEM с 5% сыворотки КРС, обработанной ПЭГ) до посадочной концентрации инфицированных клеток (400 мл разбавляют до 5 литров). После разбавления суспензии титр вируса по РГА в нулевой пробе должен быть 1:64 - 1:128. Далее разбавленную суспензию разливают на 20 матрасов по 250 мл. Матрасы помещают в термостат с температурой (36,5⁺0,5)^oC на 6 суток. После этого матрасы подвергаются замораживанию - размораживанию, вирусный материал отделяют от клеток и сливают. Вирусный материал титруют по РГА. Средний титр составляет 2¹⁴ (1: 16384). Затем вирусный материал инактивируют формалином в конечной концентрации 0,1% и используют для приготовления вакцины.

Пример 3. Получение антигена собачьего парвовируса (CPV) на культуре клеток почек кошки ПК-91.

В феврале 1993 г. из Опытно-охотничьего хозяйства по воспроизводству Западно-Сибирских лаек (с. Кубовая, Новосибирской обл.) был передан патматериал (павшая лайка). Из тонкого кишечника был приготовлен 10%-ный гомогенат, который раститрован по РГА с титром 2¹⁶, идентифицирован в реакции торможения гемагглютинации как парвовирус собак. 10%-ный гомогенат был простерилизован методом стерилизующей фильтрации. Полученным вирусным материалом инфицировали клетки почки кошки ПК-91 (FK-91), как описано в примере 2. Титр вируса в нулевой пробе 2⁵-2⁶ (1:32 - 1:64). После культивирования парвовируса собак на матрасах (как описано в примере 2) в течение семи дней титр в РГА составлял 2⁸-2⁹ (1:256 - 1:512).

Из изложенного выше видно, что полученный штамм культуры клеток почки кошки ПК-91 (FK-91) стабилен и обладает всеми признаками и качествами, присущими перевиваемым культурам, и по сравнению с известными аналогичными штаммами клеток имеет следующие преимущества. Предлагаемая культура клеток ПК-91 адаптирована к росту на питательных средах, содержащих сыворотку крупного рогатого скота, обработанную полиэтиленгликолем. Указанная сыворотка не обладает противовирусной активностью (т.к. не содержит высокомолекулярной глобулиновой фракции), является доступной и недорогой по сравнению с импортными средами. Кроме того, при получении вирусного продукта клетки вначале инфицируют (концентрация клеток больше чем посадочная в 10 раз), а затем уже инфицированные клетки рассевают на матрасы, то исключает стадию смены среды, которая необходима при инфицировании монослоя, вследствие чего сокращается общее время получения вируса. Инфицированные клетки в суспензии можно хранить до 3-х суток при температуре +4^oC. Полученный штамм культуры клеток ПК-91 позволяет получить по сравнению с аналогами более высокий средний выход вируса (для MEV - штамм "Родники", "Береговой" от 1:4096 до 1:32768 в РГА, а для CPV - 1:256).

Использование: общая и прикладная вирусология. Сущность изобретения: для культивирования клеток с целью репродукции парвовирусов плотоядных, получен штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки ПК-91, который прошел 180 пассажей, стабилен и выращивается в монослое в стационарных условиях или во вращающихся флаконах с использованием ростовой среды Игла МЕМ с 4,5% сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем, и 0,5% эмбриональной сыворотки плодов коровы. Штамм клеток ПК-91 депонирован в коллекции ВИЭВ под 49, обеспечивает выход парвовирусного энтерита норок при титровании по РГА от 1:4096 до 1:32768 и парвовируса собак при титровании по РГА 1:256.

Штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки ПК-91, ВНИИЭВ 49 для репродукции парвовирусов плотоядных.