Ингибитор размножения вируса иммунодефицита человека Советский патент 1993 года по МПК A61K31/705 

Изобретение относится к области вирусологии, медицины, а именно, к разработке и поиску новых противовирусных препаратов, обладающих анти-ВИЧ активностью.

Цель изобретения - расширение спектра противовирусных препаратов, обладающих энти-ВИЧ активностью.

Поставленная цель достигается применением пента-0-никотината глицирризиновой кислоты, 3-03-О-2,3,4-три-0-никоти- нилглюкуронопиранозил)1 (а-0-3,4-ди-0- никотинил-глюкуронопиранозид глицирре- товой кислоты (ниглизина) в качестве ингибитора размножения вируса иммунодефицита человека.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Первично инфицированные ВИЧ-1 и ВИЧ-2 клетки МТ-4 или хронически инфицированные ВИЧ-1 клетки ЭВК-ИРА/3 культивируют в присутствии препарата ниглизина, конечная концентрация которого в культу- ральной среде составляет 0,5-1.0 мг/мл и без него (контроль) на протяжении одного пассажа - в течение 4-х суток. Об ингибировании репродукции ВИЧ в клетках судят по снижению активности обратной транс- криптазы в культуральной жидкости и накоплению вирусного антигена (по данным иммуноферментного анализа) на 4-ые сутки культивирования по сравнению с контролем. Ингибирующий эффект ниглизина сравниваютсанти-ВИЧ действием азидоти- мидина и / -глицирризиновой кислоты - известных ингибиторов репродукции ВИЧ.

Предлагаемое изобретение обладает существенными отличиями, т.к. авторами впервые установлена способность ниглизина ингибировать репродукцию ВИЧ (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) в культуре клеток, не известная ранее. Приведенные ниже конкретные примеры подробно раскрывают сущность изобретения.

П р и м е р 1. Изучение влияния пента- 0-никотината глицирризиновой кислоты (ниглизина) на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4.

Суспензия инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4 с концентрацией 5 х 105 клеток/мл в питательной среде RPMT-1640, содержа W

ё

00

о

Јь

00

Јь 00

щей 10% сыворотки плода коровы, 0,06% глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночнрго культурального планшета по 200 мкл в каждую. Затем в контрольные лунки вносят по 2 мкл ДМСО, а в остальные лунки вносят по 2 мкл раствора ниглизина в ДМСО с концентрациями 100 мг/мл и 50 мг/мл до конечной концентрации ниглизина в культуральной среде, 1,0 мг/мл и 0,5 мг/мл, соответственно (берут не менее 3-х лунок на каждый вариант), В несколько пустых лунок вносят для контроля по 200 мкл суспензии неинфицированных клеток МТ-4 с концентрацией 5 х 105 клеток/мл..

Планшет закрывают и инкубируют во влажной камере СОа-инкубатора с 5% углекислого газа при температуре (36-37)°С в течение 4-х суток.

По окончании инкубации контролируют уровень вируспродукции иммунофёрмент- ным методом и методом определения активности обратной транскриптазы. Подготовку образцов для ИФА осуществляют инактиви- руя ВИЧ-1 добавлением к пробе твина-80 до конечной концентрации 0,1% с последующей инкубацией при температуре (6±2)°С в течение не менее 24 ч. Из приготовленных таким образом проб готовят ряд последовательных двукратных разведении, которые затем зносят попарно по (100±1) мкл в лунки сенсибилизированных планшетов тест-системы Вектор или Abbott. Дальнейшие операции и учет результатов проводят в соответствии с инструкцией по применению тест-системы. За титр вирусного антигена принимают то коночное разведение исходного материала, в котором достоверно выявляется антиген ВИЧ-1. Ингибирующий. эффект оценивают по отношению титров вирусного антигена в исследуемой пробе и . контроле (без добавления препарата).

Уро.вень оируспродукции оценивают также по активности обратной транскриптазы. За активность обратной транскриптазы принимают включение радиоактивной метки о импульсах на 1 мл культуральной жидкости. Ингибирующий эффект оценивают по отношению активности обратной транскриптазы в исследуемом образце и контроле (без давления препарата).

Количество живых клеток в исследуемом образце и в контролях определяют с помощью камеры Горяева после окрашивания клеток 0,4%-ным раствором трипаново- го синего. Результаты представлены в таблице 1.

П р и м е р 2. Изучение влияния пента- 0-никотината глицирризиновой кислоты

(ниглизина) на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток ЭВК-ИРА/3,

Суспензию хронически инфицированных ВИЧ-1 клеток ЭВК-ИРА/3 с концентрацией 5,5 х 105 клеток/мл в питательной среде RPMI-1640, содержащей 15% сыворотки плода коровы 0,06% глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культурального планшета по 200 мкл в каждую. Далее эксперимент проводят как описано в примере 1. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Приме р 3. Изучение влияния азйдотимидина на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4.

Суспензию инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4 с концентрацией 5,6 х 105 клеток/мл в среде RPMI-1640, содержащей

100% сыворотки плода коровы, 0,06% глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой по 180 мкл в каждую лунку 96-луночного культурального планшета. Затем в контрольные лунки вно.сят по 20 мкл ростоВой питательной среды, а в остальные лунки вносят по 20 мкл раствора азидотими- дина в питательной среде с концентрацией 100 мкг/мл до конечной концентрации азидо- тимидина в культуральной среде 10 мкг/мл.

Далее поступают так же, как описано в примере 1, Результаты приведены в таблице 1.

П р и м е р 4. Изучение влияния азидо- тимидина на репродукцию ВИЧ-1 в культуре

клеток ЭВК-ИРА/3.

Суспензию хронически инфицированных ВИЧ-1 клеток ЭВК-ИРА/3 с концентрацией 0,6 х 10 клеток/мл в питательной среде RPMt-1640, содержащей 15% сыворотки коровы, 0,06% глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой по 180 мкл в каждую лунку 96-луночного культурального планшета. Далее поступают так же, как описано в примере 3. Результаты

влияния Д-глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4. Суспензию инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4 с концентрацией 5 х ТО5 клеток/мл в питательной среде RPMI-1640, coдержащей 10%.сыворотки плода коровы, 0,06% глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культурального планшета по 200 мкл в каждую. Затем в контрольные лунки вносят по

2 мкя 96° этилового спирта, а в остальные лунки вносят по 2 мкл растворов /5-глицер- ризиновой кислоты в 96° этиловом спирте с концентрациями 100 мг/мл и 50 мг/мл до конечной концентрации/ -глицерризиновой

кислоты в культуральной жидкости 1,0 мг/мл и 0,5 мг/мл, соответственно; Далее поступают так же, как описано в примере 1. Результаты представлены в таблице 1.

П р и м е р 6. Изучение влияния /J-гли- цирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток ЭВК-ИРА/3.

Супензию хронически инфицированных ВИЧ-1 клеток ЭВК-ИРА/3 с концентрацией 5,5 х 105 к леток/мл в питательной среде RPMI-1640, содержащей 15% сыворотки плода коровы 0,06% глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культурал ьного планшета по 200 мкл в каждую. Далее поступают также, как описано в примереб. Результаты представлены в таблице 2.

Пример. Изучение влияния пента- 0-никотината глицирризиновой кислоты (ниглизина) на репродукцию ВИЧ-2 в культуре клеток..

В эксперименте используют суспензию инфицированных ВИЧ-2 клеток МТ-4.с концентрацией 5 х 105 клеток/мл в питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы, 0,06% глутамина, антибиотики. Эксперимент проводят так же, как описано в примере 1. Иммуноферментный. анализ проводят с тест-системой Вектор с использованием антигена ВИЧ-2, коньюга- та иммуноглобулинов с пероксидазой хрена, полученных из сыворотки крови больного, инфицированного ВИЧ-2 и положительной сыворотки крови,, содержащей антитела к ВИЧ-2. Результаты приведены в таблице 1.

П р и м е р 8. Изучение влияния азидо- тимидина на репродукцию ВИЧ-2 в культуре клеток.

В эксперименте используют суспензию инфицированных ВИЧ-2 клеток МТ-4 с концентрацией 5,6 х 105 клеток/мл в питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы 0,06% глутамина, антибиотики, которую вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культу- рального планшета по 180 мкл в каждую. Затем в контрольные лунки вносят по 20 мкл ростовой питательной среды, а в остальные лунки вносят по 20 мкл раствора азидотими- дина в питательной среде с концентрацией 100 мкг/мл до конечной концентрации азидотимидина в культуральной среде 10 мкг/мл, Далее поступают так же, как описано в примере 7. Результаты представлены в таблице 1.

5Из таблиц видно, что ниглизин не уступает по эффективности ингибирования ВИЧ-1 азидртимидину и даже превосходит его по эффективности ингибирования ВИЧ- 2 в культуре клеток, при этом не оказывая

0 токсического действия на клетки. При сравнении ингибирующего эффекта ниглизина и глицирризиновой кислоты видно, что оба препарата эффективно ингибируют размножение вируса в первично инфициро5 ванной ВИЧ-1 культуре клеток МТ-4, однако в хронически инфицированной ВИЧ- 1 культуре клеток ЭВК-ИРА/3 ниглизин на 60-62% подавляет репродукцию вируса, в то время как /J-глицирризинрвая кислота не

0 дает ингибирующего эффекта. Приведенные здесь экспериментальные данные убедительно показывают преимущества ниглизина по сравнению с азидотимидином (по токсичности) и с -глицирризиновой

5 кислотой (по ингибирующему эффекту на культуре хронически инфицированных ВИЧ-1 клегок).

Таким образом, применение пента-0- никотината глкцирризиновой кислоты (ни0 тлизина) в качестве ингибитора ВИЧ-1 и ВИЧ-2 позволяет расширить спектр противовирусных препаратов для борьбы со СПИД.

Наличие доступного Отечественного

5 сырья и производственной-технологической базы в г. Уфе для производства ниглизина - очень важное условие его изготовления, тогда как основное исходное соединение для синтеза азидотимидина тимидин (первона0. чально получаемый из икры лосося и сельди) производится десятистадийным синтезом американской фирмой Pfizer и в целом период с момента получения сырья до изготовления препарата составляет около семи

5 месяцев.

Формула изобретения Применение пента-0-никотината глицирризиновой кислоты в качестве вещества, проявляющегося свойства ингибитора

0 размножения вируса иммунодефицита человека.

71804848 8

Таблица 1 Ингибирование репродукции ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в культуре клеток МТ-4

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии. Цель изобретения - повышение специфической анти-ВИЧ активности. Для этого используют пента-0-ни- котинат глицирризиновой кислоты в качестве вещества, проявляющего свойства ингибитора размножения вируса иммунодефицита человека. 2 табл.

Примечание. Средние значения оценены по критерию Стьюдента для Р-0,5; н/о - не определяли,

Таблица

Ингибирование репродукции ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в хронически инфицированной культуре

клеток ЭВК-тИРА/3

Примечание. Средние значения оценены по критерию Стьюдента для Р-0,5; н/о - не определяли