Способ определения антител к вирусу клещевого энцефалита в сыворотке крови Советский патент 1990 года по МПК G01N33/53 G01N33/58 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии и касается оценки иммунитета организма к вирусу клепеврго энцефалита.

Целью изобретения является повышение чувствительности и точности способа оценки иммунитета к вирусу клепевого энцефалита.

Способ осу1цествляют следуюгдим образом. .

редованной цитотоксичности, в ко в присутствии исследуемой сыворот сорбированной на клетках-мшенях происходит их разрушение под воз вием клеток-эффекторов. Способ в чает три этапа: подготовка клето мишеней, подготовка клеток-э11эфек ров, постановка реактцш. ТТроцент цифического высвобождения Сг; считывают для каждого разведения следуемой сьшоротки по формуле.

Определение антител проводат в ре- акгщи антителозависимпй клеточноопосвыход Сг в лунке свыход/tr в лунке

% спеп фического ,исслед.сывороткойконтроля 111

высвобождениямаксимальйьгй выход спонтТвыход - b100

Сг .,

редованной цитотоксичности, в которой в присутствии исследуемой сыворотки, сорбированной на клетках-мшенях, происходит их разрушение под воздействием клеток-эффекторов. Способ включает три этапа: подготовка клеток- мишеней, подготовка клеток-э11эфекто ; ров, постановка реактцш. ТТроцент специфического высвобождения Сг; подсчитывают для каждого разведения исследуемой сьшоротки по формуле.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и предназначено для определения антител у больных клещевым энцефалитом и доноров иммунной плазмы, привитых вакциной клещевого энцефалита. Целью изобретения является повышение чувствительности и точности способа. Клетки-эффекторы добавляют к меченым хроматом натрия ⁵¹(CR) и обработанным исследуемой сывороткой клеткам-мишеням в соотношении 5/1 и при значении процента специфического высвобождения меченого хрома из разрушенных клеток-мишеней большем 12 делают вывод о наличии в сыворотке антител к вирусу клещевого энцефалита. Способ позволяет повысить чувствительность определения в 32 раза.

Для контроля ставят следуюпле пробы: контроль I - клетки-мишени плнх:

. культуральная среда (не менее двух

проб), контроль II - контроль ТОКСИЧ-,

ности сыворотки: клетки-мишени плюс исследуемая сывороттса в няимгиг ирм р всдении (1/4П), контроль П1 - коитроль ЦИТОТПКСИЧНОСТИ lUfpycCHf-HHillH ескпх ЛНГ-1ФОГ11-ТТОИ ; гслетки-у- гишспчплюс клетки-эфгЬектопьг. контрохгь 1У - контроль спеляфичнос.ти лизиса клеток MTiiMeHen: гусиные эритршунты, ci6pa- ботлниые тапилом ллкю. клетки-эффекTopl,.

Все пробы, опытные или контрольны Став; в оО-ьемах: 05220 мл. В

опытных ri КОНТР0. Пробах СООТИС пь шие клетки-эффекторы ; клетки-мй- М1еии одинаково. Реакции учитыпают только я г. нетоксич1;остн i-Eccjie- ЛУекон сыиороткп /,, кЛеток-митенеГ (следифическое ныспобожделие С г в контроле II. лк более, чем cnovrraii- ное высвобокдеаие , За максималную активность лринима(от активность О,, J 10 мл срел,ы 1-гг лу1Л(;и 5чо:)-:троля I после- тр(ательног о перемеп1ивания ее содержимого, спонтсяиный шлход

ра диоак ТИР, line, ти лрршима ют актин ноет ь мл сулернатянта из лунки конт- ро.ш1 I. . .

П р и м е.р. Подготовка клеток- Мишелей. Гусинь е эритро иты , взятые в раствор Лльсенера, двукратно от- мываит фосфатно-солбвым буфером (ФСБ с рН 7, 25 готовят нз.весь эритроди тов в этом буфере К 1 мл 5%-шзй взвеси эритроцитов /юбавлятот 1 мл раствора танина, разведенного 1:20000 в ФСБ с рН 7,2, инкубируют 20 мин ттри ком- латной температуре 5 затем трехкратно отмглтают в ФСБ с рН 7,2 71пк сенси- билизацЮ зрнтро1дитон используют коммерческий дкагностикум клещевого энцефалита производства Томского НИИ вакцин и сьгоороток для РТГЛ и РСК,,Тиаг- ностикум рйзводят 1 № О,15 М NaCl.1 мл разведенного я,иаг ностикума смешивают .с 4 мл (ЬСВ с pFf 6/к Смесь стабилизи руют лоп адиным сывороточным альбуг-ш- ном в конечной концентратгдпт 0,5% и инкубируют 20 мин при комнатной тем- .пературе, отм1,шают 3 раза в ФСБ с рН 7,2 с 0,5% лотадикого сывороточно го альбуг гина,

К осг1д,ку полученньк клеток -1ишене добавляют 1 мл культуральном среды с Х;:гматом натрия Сг до конечной . ко-п;;; ,i г ;);711Кй изотола В с.успензии кле ток /: -)0 Клетки-мнгаеии метят в i t-1( :)иг- fjQ мин при 37 С, затем трехкрат)1г-, отгч.р .яют от несвязавшегося . больпггпчда о ъемами раствора X-JH;-. , , г,оволлт количество клеток до 5-10- I t мл культуральной среды.

Подг - тов;сл кло ок-зффекторов. . Л качестве к-ггр-т-ок-эфФекторов ис- лользуит моионук са| ы лериферической кроли, пьгдс.псиные из гилрринизирован- ной крояи в .градиенте плотности фиколл- гилак :п... методу Бейум. Клетки-эффекоры .отмывают трпльратно раствором Хэикса и ДОРОДЯ- ,4w онцентралки

КГ1 культуральной

2,:: -W кле---к

npi- г;ск;тлновке псакции используют xv ;ij yp.;EbH-v,; ср ;;;; - :ледующего соста р;;; KPMt-ifi с 10% инактивированноч Фатальной сыкорстхи и 2 кМ Hepes.

Иссле,п,усму:о см75протку (донора, больногг; клс1певым :;;:лгеЛа;штом) инак- тиинруют 30 мин при , готовят ее дпукра п-rbip иосл;итовательнме разведе- ния , Кпеткм-мнпсв - гтомер;ают в лунки Jb 4yHo4Kon luiaHr-ieTbi для иммуноло- гическмх реакций в объеме 0.1 мл (ио клеток ил JiyHKv), добавляют к ним исслолуямуга сч -;оротку в объеме и,01 мл так,, чтобы конечная концентря Д- н CMTiopo CKn: н лутп р составила i/ 0 - 1/5120,, инкубируют 1 ч при 4 С., атег: л каждую из лунок, содержа пдх последовптельнь е разведения сывороток от 1/40 до 1/5120, вносят по О, мл клеток-зффекторов, планшету. центрифугипуют 2 мин при 800g, инкубируют 12 ч в атмосфере 5%-ного СО,. После окончания ин убаг1ии из каждой лунки отбирают сулерпатант в объеме OjTIO мл и исслед/даг радиоактивность гфобы на гамма-счетчике Гамма 12.

JtpoH,eHT слециф;ччс ского высвобождения 5fcr подсчрггывя.от с использованием формулы

При постановке реакции соотношение клетки-эффекторы : клеТки-Mi-trae- ни в лунке равно 5:1.

Результаты определения показывают, т п титр антител в исследуемой сыворотке составляет 1:2560.

Предлагаемый способ повьппает. чувствитальность определения антител по срав- )енр1ю с прототипом в 32 раза, результат при зтом о: .снлвают по гшфро- вому ма.териазг1 5 что ловьппает точность и исключает ,активность опре- делеШ Гя ,

Формула и 3 о б

Р е т е н и я

Способ определения антител к вирусу клегченого энцефалита Р сыворотке крови путем приготовления последовательных разведений иccлeдye fЬй сыво ротк и инкубирования с антигеном с использованием гусиных эритроцитов, о г л и.ч а ю г и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности и точности способа, гусиные эритроциты обрабатывают танином, сенсибилизи1597726

ругот днягностикумом клещевого энцефалита, метят хроматом натрия Сг, обрабатывают исследуемой сывороткой, добавляйт мононуклеары периферической крови в соотногаении 5:1, дополнительно инкубируют, определяют процент специфического высвобождения меченрго хрома из разрупенных клетбк- мзшеней и при его значении, большем 12, делают вывод о присутствии в сьшоротке антител к вирусу клещевого энцефалита.