Способ определения антител к вирусу клещевого энцефалита в асцитной жидкости Советский патент 1990 года по МПК G01N33/53 

оглобулинам исследуемого образца в | озе 2-8 преципитирующих в РДПА (реакции диффузной преципитации в агаре единиц. Смесь инкубируют дополнитель- 5 но в течение 60+10 мин при 37+1°С в атмосфере 3+0,5% СО. После повтор- ного инкубирования в каждую лунку планшеты к смеси вирус-исследуемый об- разец-антииммуноглобулиновая сыворот-JQ ка добавляют по 50+2 мкл суспензии клеток U-937 в дозе 800+5 тыс/мл, приготовленной по среде RPMI-1640 с добавлением 0,03tO,005 глютамина и Ю+2% эмбриональной телячьей сьгоо- 15 ротки. В контролях используют смеси вируса с сывороткой, содержащей (по данным дргуих серологических тестов ) антитела к вирусу КЭ, вируса с нормальной сывороткой гомологичной по 20 иммуноглобулинам обследуемому образцу; вируса с антисывороткой к иммуно- глобулинам, отличным от используемых в опыте с исследуемым образцом.

Спустя 96+4 ч после инкубирования 25 планшеты при 37+1°С в атмосфере с 3+0,5% С0гиз ЛУНОК отсасывают 0,15+ +0,002 мл надосадочной жидкости, до-,, бавляют 0,15+0,002 мл физиологического раствора, содержимое лунок пере- 30 мешивают интенсивным пипетированием и переносят на поверхность предметного стекла 20+0,005 мкл суспензии клеток. Каплю подсушивают на открытом воздухе при комнатной температуре. 35 Подсушенный материал на поверхности, стекла фиксируют в охлажденном до -20f2°C ацетоне в течение 20±2 мин. Результаты способа учитывают с помощью непрямого иммунофлуоресцентного мето-40 да, где используют антитела к вирусу КЭ и меченные флуоресцеином антитела к соответствующим иммуноглобулинам.

В исследуемых каппях суспензий клеток U-937 подсчитывает количество клеток со специфической флуоресценцией из расчета на 500 обследованных клеток. Результат считают положительным при увеличении дэли содержащих ан45

50

тиген вируса КЭ клеток в сравнении с

контролем (вирус + нормальная сыворотка + антииммуноглобулин) при Р 0,05.

Предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность по сравнению с известным в 100 раз, так как при добавлении антииммуноглобулинов эффект усиления репликации вируса клещевого энцефалита в клетках U-937 регистри

руют при больших разведениях исследуемого образца.

Способ позволяет регистрировать положительную реакцию при разведении исследуемой иммунной к вирусу КЭ ас- цитной жидкости мышей 1:10-Ј,

Пример 1 о Готовят десятикратные разведения вируса КЭ и исследуемой иммунной асцитной жидкости на среде РРМ1-1640 с добавлением 0,03 мг/мл глютамина. Смешивают в лунках стерильной планшеты для иммунологических реакций в объеме по 50 мкл суспензии вируса в дозе 10 БОЕ/0,1 мл с исследуемым образцом в дозе от 1:10 до 1:107,

Смесь инкубируют при 37°С в течение 60 мин в атмосфере 3% СО.,. Затем к смеси вирус-антитела добавляют по 50+2 мкл антисыворотки к иммуноглобулинам исследуемого образца в дозе 4 преципитирующих в РДПА иммуноглобулины единиц. Смесь инкубируют дополнительно в течение 60 мин при 37°С в атмосфере 3% СО. После повторного инкубирования в каждую лунку планшеты к смеси вирус-исследуемый образец-антииммуноглобулиновая сыворотка добавляют по 50 мкл суспензии клеток Ы-937 в дозе 800 тыс/мл, приготовленной на среде RPMI-1640 с добавлением 0, 03 мг/мл глютамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. В контролях используют смеси вируса с сывороткой мышей иммунной по данным иммуноферментного метода к вирусу КЗ, вируса с нормальной сывороткой, гомологичной по иммуноглобулинам исследуемому образцу (мышиная сыворотка); вируса с антисывороткой к иммуноглобулинам кролика.

Спустя 96 ч после инкубирования планшеты при 37 аС в атмосфере с 3% С01 из лунок отсасывают 0,15 мл не- досадочной жидкости, добавляют 0,15 мл физиологического раствора, содержимое лунок перемешивают интенсивным пипетированием и переносят на поверхность предметного стекла 20 мкл суспензии клеток. Каплю подсушивают на открытом воздухе при комнатной температуре. Подсушенный материал фиксируют в охлажденном до -20 С ацетоне в течение 20 мин. Результаты способа учитывают с помощью иммунофлюоресцент- ного метода, где используют антитела кролика к вирусу КЭ и меченные флуорес51562857

енном антитела к иммуноглобулинам ролика.

Ф су жи с кл р ра т л ц сп ды н сы ви 2П р и м е р 2. Определение антител к вирусу КЭ в асцитной жидкости мышей при инкубировании в течение

30 мин,

I

Готовят десятикратные разведения суспензии вируса КЭ и исследуемой иммунной жидкости мышей как в примере 1. Инкубируют смесь вирус-асцит- ная жидкость на первом этапе и смеси вирус-асцитная жидкость-антииммуноглобулина на втором этапе при 37°С в течение 30 мин. Дальнейшую обработку проводят как в примере 1.

0

5

6

Формула изобретения Способ определения антител к вирусу клещевого энцефалита в асцитной жидкости путем инкубирования вируса с исследуемым образцом, добавления клеток макрофагапьно-моноцитарного ряда, культивирования и оценки Титра антител по увеличению числа клеток, инфицированных вирусом, отличающийся тем, что, с целью увеличения чувствительности способа, инкубирование проводят дваж- ды по 30-90 мин, причем при повторном инкубировании добавляют антисыворотку к иммуноглобулинам против вируса клещевого энцефалита в дозе 28 преципитирующих единиц.

Изобретение относится к медицинской вирусологии, а именно к иммунологическому определению антител к вирусу клещевого энцефалита (КЭ). Цель изобретения - увеличение чувствительности определения субнейтрализующих количеств антител к вирусу КЭ в тесте антителозависимого усиления репликации вируса КЭ. Способ заключается в дополнительной инкубации инфекционных комплексов с антисывороткой. После первого этапа реакции в течение 30 - 90 мин в смесь вирус-антитела добавляют антисыворотку против иммуноглобулинов исследуемого образца в дозе 2 - 8 преципитирующих в реакции диффузионной преципитации в агаре единиц. Определяемые антитела реагируют с вирусом КЭ, а сформированные инфекционные комплексы, несущие иммуноглобулины, с соответствующими антииммуноглобулинами. Сформированные инфекционные комплексы вирус-антитела - иммуноглобулины посредством FC-фрагментов антител из исследуемого образца антииммуноглобулинов взаимодействуют с FC-рецепторами клеток макрофагального ряда U-937. Наличие и титр антител учитывают с помощью иммунофлуоресцентного теста по увеличению числа клеток, содержащих специфический вирусный антиген. Способ позволяет повысить чувствительность по сравнению с прототипом в 100 раз и регистрировать положительную реакцию при разведении иммунного к вирусу КЭ образца 1:10^-6.