Способ определения дыхательной активности микроорганизмов Советский патент 1990 года по МПК C12Q1/02 

At,

Изобретение относится к микробиологии и может найти применение в биотехнологии при производстве препаратов путем микробиологического синтеза. где К

Цель изобретения - повышение чувствительности способа и его упрощениеСпособ заключается в том, что в пробу вводят длиннолюминесцирующий (сС ) флуорохром на носителе ковалентно к/или сорбционно связанный с ним, рег стрирук т кинетику изменения уровня сигнала длительной люминесценции, а дыхательную активность Atj - рассчитьшают по формуле

-

At,

К

tj -

А,5

К 2,2 At, - 0,8itj

- константа тушения флуорохро- ма кислородом;

интервал времени, за который уровень длительной люминесценции увеличился от 0,1 1„ до 0,2 Т„ (1 - уро- вень максимально1 (з свечения пробы после погло цения из среды кислорода); интервал времени, соответствующий возрастанию интенЮ

00

о:

сивности люминесцении с 0,1 1 до 0,5 Ifl.

В качестве флуоррхромов используют широкий набор длиннолюминесцирующих соединений Хароматические углеводороды, гетероциклические соединения, на- пример порфирины и их металлокомплек- сы, пирен, бензопирен, флавины и их производные). В качестве носителей используют белки, ковалентно или адсорб- ционно связанные с флуорохромом, ла- тексные частицы и другие сорбенты.

Использование в качестве индикатсэ- ра флуо рохрома на носителе резко уве-- личивает его способность к длительной .люминесценции за счет устранения тушащего действия воды.

Предлагаемый способ обеспечивает повьшение чувствительности. Это обес- печивается двумя факторами: исключением дозирования кислорода с помощью водного раствора и введением в пробу индикатора с известной характеристи- кой тушения кислородом его длительной люминесценции. Введение этих операций позволяет резко уменьшить объем анализируемых проб до единиц микролит- ров, т.е. повысить чувствительность

анализа.

Оптимальным диапазоном для регистрации I,, la, Ij является диапазон от 0,1 1о ДО 1о. Это связано с тем, что при .1, 0,1 IQ возрастает ошибка от вклада длиннолюминесцирующих примесей, а при Ij 0,1 микро- организмов может существовать альтернативный путь поглощения кислорода, вклад от которого заметен лишь при крайне низких концентрациях кислоро-

да.

Вклад .альтернативного пути поглощения кислорода становится заметным при I 0,5 I , т.е. при концентра- циях кислорода, много меньших коне- танты Михаэлиса основного пути.

Способ поясняется следук)щими при мерами.

П р и м е р 1. Металлопорфирид

(флуорохром) растворяют в воде (10 М и смешивают с карбодиимидом в соотношении 1:2 (М), после 30 мин инкубаци при комнатной температуре в реакционную смесь добавляют белок (бьиий сы вороточный альбумин) в молярном отно щении 10:1 (флуорохром г белок). Через . 4 ч инкубации гельфильтрацией на колонке с сефадексом G-50 отделяют кон югат от свободного (несвязавшегося)

металлопорфирина. В качестве злюента используют трис-буфер (рН 7,2). Конъю- гат (флуорохром-белок) разливают по отдельным ампулам и высушивают лио- фильно.,

П р.и м е р 2. Один из флуорохро. мов (эозин, бензопирен, пирен, лопорфирин) растворяют в воде (10 М) и смешивают с меламинформальдегидной смесью по известному способу. Затем проводят отмывку латексов от несвя- завшегося флуорохрома седиментацией или центрифугированием. Латексы хра- нят в виде водного раствора.

.Пример 3. Латексы с флуоресцентной меткой на основе полистирола получают смешиванием флуорохрома с эмульсией стирола с последующей его полимеризацией.

Затем реакционную смесь освобождают центрифугированием или седиментацией от свободного флуорохрома. Латексы хранят в виде эмульсии или лиофиль но высушенных частиц.

Пример 4. В кварцевую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой пробы с Е. coli М-17 в виде водной суспензии с концентрацией клеток 10 микроб- ньк тел в мл (м.т./мл) и 10 мкл бычьего сывороточного альбумина, ковалентно связанного с цинкпротопорфири- ном IX. Концентрация белка 1 мг/мл, соотношение белок:флуорохром 1:10. (в молях).

Пробу помещают в кюветное отделение флуориметра с временным разрешением, облучают видимым светом (АОО- 700 нм) от лампы накаливания марки КГМ 15 Вт и фотоприемником ФЭУ-11А регистрируют кинетику изменения сигf - ---.в.- . f f

нала длительной люминесценции (с с - ) в процессе поглощения кислорода.

На чертеже представлена кинетика (А) изменения сигнала длительной люминесценции в процессе поглощения кислорода..

Находят время увеличения сигнала с 0,1 до 0,2 Ij, и до 0,5 1о, равное 1 .и 2 мин соответственно. С учетом константы тушения ,для цинкпротопорфи- рина IX, равной 1,6 10 м , по формуле получают величину дыхательной активности микроорганизмов в пробе, равную 0,47 10 М ССг /мин- 10 м. т.

Пример 5. Способ осуществляют аналогично примеру 1. В качестве .флуорохрома используют пирен, в качестве носителя - частицы полистирола диаметром 5-20 мкм. Концентрация пи- рева в пробе .

На чертеже представлена кинетика (В) изменения сигнала длительной лю- минесценции флуорохрома в процессе поглощения кислорода из пробы. С учетом константы тушения для данного флуорохрома К( 8 10 а времена &t , 0,57 мин, itj 1,08 мин расчетом по формуле находят дыхательную активность микроорганизмов в пробе, равную 0,47 bjl/MHH . 109 м.т.

Из сравнительных данных примеров 1 и 2 видно, что независимо от типа используемого флуорохрома и носителя скорость поглощения кислорода в обоих случаях оказалась равной.

Пример 6. Ампулу с вакциной БЦЖ (1 мг сухой биомассы) вскрывают и разводят дистиллированной водой (0,2 мл). После регистрации в течение 15 мин суспензию микроорганизмов пере-

носят в измерительную ампулу диаметром 25 увеличивается ошибка определения, 5 мм и вносят 10 мкл меламинформальдегидных латексов (2,5 -10 мл) с трипа- флавином (3 ). Время восстановления люминесценции от 0,1 I Л1с,кс До уровня 0,2 составило 9 мин, а до уровня 0,5 IMOKC мин соответственно. С учетом константы тушения Кл 2 Ю м для трипафлавина скорость поглощения кислорода, рассчитанная по формуле, составляет

30

связанная с некорректностью приема дозирования кислорода.

Таким образом, предлагаемый спо может быть использован для решения различных задач п области биотехно гии, где необходимо производить оц ку дыхательной активности в малых емах проб с низкой концентрацией к ток или с низким уровнем дыхательн активности.

1

2 - 107 2,2

А,5

0,5 10

-7

9 - 0,8 16

.5

19,8 - 10,i

„-7

0,25- М /мин/мг сух. массы

Пример 7. В кварцевую пробирку диаметром 2 мм вносят 5 мкл пробы, содержащей 10 клеток дрожжей Sac- charomyces cerevisiae и 2 мкл конъюга- та бьмьего сывороточного альбумина с А1(ОН)-компропорфирином в концентрации 10 мг/мл и молярном соотношении белок;порфирин 1:10.

Пробирку с пробой помещают в кювет- иое отделение флуориметра с временным разрешение:-;, облучают видимым светом от лампы пакаливания КШ 15 Вт и фото- приемнико--{ ФЭУ-114 регистрируют кинетику изменения сигнала длительной люминесценции (с С ) в процессе поглощения кислорода. На чертеже представлена кинетика (В) изменения сигнала в процессе поглощения кислорода. Расчетом по формуле с учетом ДС, 2 мин, а Atj, 4 мин и константы тушения для данного флуорохрома, равной К,;, 1,8 10 м находят дыхательную активность микроорганизмов в пробе, равную 2,8 10 К Ог /минх X 10 м.т.

В таблице представлены данные по сравнительной с известным способом

оценке чувствительности предлагаемого. В качестве флуорохрома на носителе использовали А1(ОН) на бычьем сывороточном альбумине.

Из данных таблицы видно, что прёдлагаемый способ позволяет повысить чувствительность анализа за счет резкого уменычения объема анализируемых проб. При уменьшении обг,ема пробы с 1 мл до 0,1 мл в прототипе заметно

25 увеличивается ошибка определения,

30

35

0

5

0

связанная с некорректностью приема дозирования кислорода.

Таким образом, предлагаемый способ может быть использован для решения различных задач п области биотехнологии, где необходимо производить оценку дыхательной активности в малых объемах проб с низкой концентрацией клеток или с низким уровнем дыхательной активности.

Формула изобретения.

Способ определения дыхательной активности микроорганизмов путем введения в пробу флуорохромов, облучения пробы светом и регистрадш кинетики изменемия сигнала длительной люминесценции с последующей оценкой результа - та, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения анализа, из флуорохромов используют длиннолюминесцирующнй (linyopoxpoM с 6 на носителе, а оценку результата ведут по формуле

Vo

J К,

4,5

2,2 ut , - 0,8 At.,

где V g

Ч

- дыхательная активность;

- константа тушения люминесценции, флуорохрома кислородом,

1602869

интервал времени, соответ ствутощий увеличению сигнала люминесценции от О,1,Ig до 0,2 1д, 1 - максимальный уровень люминесценции про8

бы после поглощения кислорода;

- интервал времени, соответстг вующий увеличению уровня люминесценции от 0,1 1 до 0,5 1о.

Изобретение может быть использовано в биотехнологии при производстве препаратов путем микробиологического синтеза. Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа. В кварцевую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой пробы с E.COLI М-17 в виде водной суспензии с концентрацией клеток 10⁹ микробных тел в 1 мл и 10 мкл бычьего сывороточного альбумина, ковалентно связанного с цинкпротопорфирином IX. Концентрация белка 1 мг/мл, соотношение белок - флуорохром 1:10 (в молях). Пробу помещают в кюветное отделение флуориметра с временным разрешением, облучают видимым светом от лампы накаливания и регистрируют фотоприемником кинетику изменения сигнала длительной люминесценции с Τ*9810^-4 с в процессе поглощения кислорода. Способ заключается во введении длиннолюминесцирующего (с Τ*9810^-4 с) флуорохрома на носителе и измерении кинетики изменения сигнала с последующей оценкой результата по формуле. 1 ил., 1 табл.