Способ извлечения нуклеиновых кислот из геля Советский патент 1990 года по МПК C07H21/00 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способам выделения и фракционирования нуклеиновых кислот.

Целью изобретения является увапи- чение выхода и упрощение способа.

По окончании разделяющего электрофореза перпендикулярно направлению электрического поля, параллельно краю разделяющего геля формируют слой геля желатины (5-10%) с зазором между ними 1-1,5 t jM, заполняемым буфером. Вслед за этим к комбинированному гелю прикладывают электрическое поле того же

н.аправления, что и при разделении, и поддерживают его до выхода нуклеиновых кислот из разделяющего геля. Свойства геля желатины (малые размеры пор) определяют неспособность молекул нуклеиновых кислот проникать внутрь геля,следствием чего является осаждение молекул ДНК и РНК на внешней по отношению к разделяющему гелю поверхности геля желатины. Далее слой желатины (0,8- 1,2 мм толщиной)- срезают, вычленяют конкретные зоны и расплавляют при 37- . Нуклеиновые кислоты отделяют от желатины экстракцией фенолом.

О5 О О5 ел

Предложенный способ обеспечивает 95% элюцию молекул и фрагментов РНК и дак разного молекулярного веса, в том числе и высокомолекулярных.

П р и м ер 1. В горизонтальном. приборе для электрофореза параллель но краю 0,8%-ного геля агарозы размерами 60x10x3 мм, содержащего зону ДИК плазмиды pBR 322 (10 мкг), формируют слой 5%-ного геля желатины размерами 60x10x3 мм с зазором между ними 1 мм. Зазор заполняют электрофорезным буфе ром. К комбинированному гелю прилагают электрическое поле напряжением 10 В в течение 2ч. После этого с поверхности геля желатины, обращенной к агарозному гелю срезают слой 60 х X 3 мм и толщиной около 1 мм. Фрагмент геля, содержащий плазмидную ДНК, помещают в центрифужную пробирку, расплавляют при 37 °С в течение 5 мин и перемешивают с равным объемом фенола, насьщенного буфером. После разделения фаз центрифугированием водную фазу отбирают. После удаления следов фенола измеряют выход ДНК. Он составил более 95%.

Пример 2, Отличается от примера 1 тем, что из 0,7%-ного геля araрозы (50x20x3) указанным способом проводят элюцию BgIll-фрагмента (17,4 т.п.и.) ДНК фага Т4. Элюирующий электрофорез проводят при 10 В в течение 8 ч. Выход фрагмента ДНК более 95%.

Пример 3, Осуществляют аналогично примеру 1, но из комбинированного 2%-ного полиакриламида - 0,5% ного агарозного геля (100x10x3) проводят элюцию РНК фага на поверхность 10%-ного геля желатины (60x10x3). Режим элюирующего электрофореза - 20 В, 4 ч. Вьпсод РНК более 95%.

Пример .4. Отличается от при- мера 1 тем, что из 10%-ного полиакрил амидного геля (50x20x3) элюируют ука

0

5

0 5

jQ

.5

35

заиньм способом apj 58 РНК Е. coli на поверхность 5%-ного геля желатины (10x20x3). Режим электрофореза - 20 В, 6 ч.. Выход 5S РНК, более 95/ :,

Таким образом, предлагаемьй способ позволяет добиться почти полного (95%) выхода нуклеиновых кислот разного молекулярного веса из разделяющего и элюирующего гелей, дает воз можность отказаться от дорогостоящей легкоплавкой агарозы, обеспечивает стабильность нуклеиновых кислот, спо- собных денатурировать в интервале температур 38 65 С, позволяет концентрировать нуклеотидный материал на поверхности желатины и исключает его разбавление при экстракции фЪнолом, обеспечивает возможность элюции из различных типов гелей и, наконец, получаемые элюаты не содержат примесей, ингибирующих разного рода ферйентатив- ные активности, в том числе зндонук- леазные.

Все это позволяет широко использовать описанный подход в генной инженерии и различных молекулярно-биологических исследований, связанных с разделением и получением нуклеиновых кислот и их фрагментов.

Формула изобретения

Способ извлечения нуклеиновых кислот из геля,, предусматривающий проведение электрофореза, расплавление геля, экстракцию фенолом, о т л и - чающийся тем, что, с целью довьшения выхода и упрощения способа, перед электрофорезом, параллельно ,краю разделяющего геля и перпендикулярно силовым линиям электрическо о поля, формируют слой геля желатины концентрацией 5 - 10%, причем между гелями оставляют зазор, заполненный буфером, а расплавляют слой геля желатины, обращенньш к агарозному гелю.

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способам выделения и фракционирования нуклеиновых кислот. Цель изобретения - повышение выхода и упрощение способа элюирования нуклеиновых кислот из гелей. Отличительной чертой предлагаемого способа является формирование слоя геля желатины концентраций 5-10% параллельно краю разделяющего геля (полиакрилламид, агароза), причем между гелями оставляют зазор, заполненный буфером, затем осаждают нуклеиновые кислоты на геле желатины, прикладывая к комбинированному гелю электрическое поле, в направлении, перпендикулярном разделяющему. После этого с поверхности геля желатины срезают слой толщиной около 1 мм, вырезают зоны, соответствующие нуклеиновым кислотам, и расплавляют их при 37-38°С. Нуклеиновые кислоты отделяют от желатины экстракцией фенолом. Выход РНК и фрагментов ДНК, размеры которых ограничиваются возможностями разделяющего геля, составляет более 95%. Предлагаемый метод может найти широкое применение в важнейшем направлении биотехнологии - генной инженерии и различных областях молекулярной биологии, связанных с выделением нуклеиновых кислот и их фрагментов.