Способ получения ферментов из биомассы BacILLUS амYLоLIQUеFасIеNS штамм ВКПМ В-3188 Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано для получения ферментов нуклеинового обмена, в частности эндо- и экзонуклеаз, которые находят широкое применение в генной инженерии для анализа и конструирования рекомбинатных ДНК.

Целью изобретения является повышение чистоты целевых продуктов и степени использования исходной биомассы.

Способ заключается в том, что биомассу B.amyloliquefaciens штамм ВКПМ В-3188 разрушают, клеточный экстракт после хроматографии на фосфоцеллюлозе подвергают дополнительной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Активность ондонуклеа- зы Bam HI обнаруживается во фракциях, элюируемых 0,1-0,2 М NaCI, а фракции, содержащие экзонуклеазную активность, элю- ируются 0,05-0,1 М NaCi

Дальнейшую очистку Bam Hi осуществляют хроматографиями на колонках с гидро- ксиапатитом и Bio-Rex 70 В результате получают препарат Bam HI, очищенный в 1720 раз, с удельной активностью 493600 ед.акт./мг белка, где за 1 ед.акт. принято

количество белка, катализирующее расщепление 1 мкг ДНК бактериофага за 1 ч при 37° С в буфере (6 мМ трисНС, рН 7,5), содержащем 6 мМ MgCl2 и 6 мМ/ -меркаптоэтанол. Для получения электрофоретически гомогенного препарата экзонуклеазы фракции с колонки с ДЭАЭ-целлюлозой, содержащие экзонуклеазную активность, очищают дополнительно на колонках с ами- ногексилсефарозой и ДНК-целлюлозой. Исследование свойств полученной экзонуклеазы показывает, что фермент имеет мол.м. 29 КД, является 3 -экзонуклеазой, специфичной к двуспиральной ДН К, и обладает дополнительно активностями: РНК- азы Н, 3 -фосфатазы и АР-эндонуклеазы.

Изучение обнаруженной в B.amyloliquefaciens штамм ВКПМ В-3188 .экзонуклеазы показывает, что фермент является аналогом экзонуклеазы II E.coll, но обладает повышенной специфичностью к структуре 3 -конца ДНК по сравнению с экзонуклаазой П E.coli, Это обеспечивает преимущество использования экзонуклеазы III B.amyloliquefaciens в генноинженер- ных и биотехнологических экспериментах.

Тримеры конкрэтного выполнения способа приведены .

П р и м е р 1. Выделение экзонуклеазы III и эндонуклеаз.ы Barn Hi из B.amyloliquefaciens.

Получение клеточного экстракта. 100 г биомассы B.amyloliquefaciens штамм ВКПМ В-3188 размораживают и суспендируют в буфере (200 мМ трисНС, рН 7,5), содержащем 5 мМ / -меркаптоэтанол (буфер Б). К суспензии добавляют 2 мл раствора лизоци- ма (10 мг/мл) в буфере (1 М трисНС, рН 7,5) и лизис клеток проводят в течение 1 ч. Лизат обрабатывают ультразвуком при 200-300 Вт, 20 кГц (10x30 см, при, охлаждении ) и центрифугируют при 20000° С в течение 1 ч.

Р-1

Хроматография на фосфоцеллюлозе

Клеточный экстракт наносят на колонку с фосфоиеллюлозой (2,6x25 см), уравновешенную буфером Б, колонку промывают 0,5 л буфера Б и белок элюируют 2 л линейного градиента NaCI от 0 до 0,5 М в буфере Б. Скорость нанесения, промывки и элюции 30 мл/ч. Экзонуклеаза III элюируется на этой стадии совместно с рестриктазой Bam HI при 0,3-0,5 М NaCI. Фракции, содержащие обе эти активности, объединяют, осаждают белки добавлением сульфата аммония до 70% насыщения. Сформировавшийся в течение 15 ч осадок отделяют центрифугированием при 20000д в течение 30 лин,

растворяют в 90 мл буфера Б и диализуют против 4 л того же буфера в течение 10 ч.

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе (разделение Bam HI и экзонуклеазы III). Раствор фермента после диализа освобождают от выпавшего осадка центрифугированием и наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (1,6x40 см), уравновешенную буфером Б. Колонку промывают 200 мл буфера Б, белки

элюируют линейным градиентом концентрации NaCI 0-0,4 М в том же буфере. Общий объем градиента 400 мл. Фракции в интервале 0,05-0,1 М NaCI содержат свободную от Ват Н экзонуклеазу III, эндонуклеаза

Ват HI элюируется 0,1-0,2 М NaCI. Фракции, содержащие экзонуклеазу III, подвергают дальнейшей очистке.

Хроматография экзонуклеазы III на гид- роксиапатите.

Препарат экзонуклеазы III после ДЭАЭ- целлюлозной хроматографии наносят на ко- лонку с гидроксиапатитом (1,6x5 см), уравновешенную 10 мМ калийфосфатным буфером, рН 7, содержащим 10 мМ / -меркаптоэтанол (буфер В). Колонку промывают 50 мл буфера В и фермент элюируют калий- фосфатным буфером, рН 7, содержащим 10 мМ /3 -меркаптоэтанол, с градиентом фосфата калия от 0,01 до 0,6 М. Общий объем

градиента 60 мл. Скорость чанесения, промывки и элюции 3 мл/ч. Фракции, содержащие экзонуклеазу (0,18-0,25 М К-фосфата), объединяют и диализуют в течение 12ч против 1 л буфера Б.

Хроматография экзонуклеазы Ш на ами- ногексилсефарозе.

Полученный диализат в количестве 10 мл наносят на колонку с аминогексилсефа- розой (0,8-20 см), уравновешенную буфером Б. Колонку промывают 20 мл буфера Б, фермент элюируют градиентом концентрации NaCI 0-0,75 М в буфере Б. Общий объем градиента 150 мл. Скорость нанесения, промывки и элюции 3 мл/ч. Фракции, содержащие экзонуклеазу, элюируемые в градиенте NaCI 0,14-0,18 М, объединяют и диамезуют в течение 12 ч против 1 л буфера Б. Хроматография на аминогексилсефарозе обеспе- чивает 10-кратную очистку фермента при

0 полном сохранении экзонуклеазной активности.

Хроматография на ДНК-целлюлозе. Раствор фермента после диализа нано- 5 сят на колонку с ДНК-целлюлозой (0,5x10 см), уравновешенную буфером Б Колонку промывают 20 мл буфера Б и элюируют линейным градиентом NaCI 0-1 М в том же буфере. Общий объем градиента 20

мл. Скорость нанесения, промывки и элю- ции 1 мл/ч. Фракции, содержащие фермент (0,25-0,45 М NaCI), объединяют и концентрируют диализом против 100 мл буфера Б с 50%-ным глицерином. Таким образом, из 100 г биомассы B.amyloliquefaciens штамм ВКПМ В-3188 получают 0,04 мг электрофо- ретически гомогенной экзонуклеазы с удельной активностью 1350 ед.акт./мг, измеренной по методу Ричардсона.

Препарат эндонуклеазы Bam HI, отделившийся от экзонуклеазы III, после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе также подвергают дальнейшей очистке.

Хроматография эндонуклеазы Bam HI на гидроксиапатите.

Препарат эндонуклеазы Bam HI наносят на колонку с гидроксиапатитом (1,5x5 см), уравновешенную 10 мМ К-фос- фатным буфером, рН 7, содержащим 0,1 М NaCI, 5 мМ /3 -меркаптоэтанол. Колонку промывают 50 мл того же буфера, белок элюируют 60 мл линейного градиента К-фос- фата калийфосфатнолго буфера, рН 7, от 0,01 до 0,6 М, содержащего 0,1 М NaCI и 5 мМ / -меркаптоэтанол. Фракции, содержащие активность Bam HI, элюируются в интервале от 0,12 до 0,36 М К-фосфата.

Хроматография эндонуклеазы Bam HI на Bio-Rex 70.

Объединенные фракции после хроматографии на гидроксиапатите диализуют в течение 20 ч против 1 л буфера Б, меняя буфер дважды, и наносят на колонку с Bio- Rex 70 (0,8x5 см), уравновешенную буфером Б. Колонку промывают 20 мл того же буфера, элюцию белка осуществляют 60 мл линейного градиента NaCI от 0 до 1 М в буфере Б. Скорость нанесения, промывки и элюции 4 мл/ч. Фермент Bam HI элюируют 0,1-0,35 М NaCI.

Фракции, содержащие Bam HI, объединяют и концентрируют диализом против буфера Б в 50%-ном глицерине. В результате из 100 г клеток Bacillus amyloliquefaciens получают 2,5 мг белка с удельной активностью 493600 ед.акт./мг белка.

Данные по выделению Bam HI эндонуклеазы приведены в табл.1.

Проверка чистоты эндонуклеазы Bam HI.

Для проверки чистоты полученного препарата эндонуклеазы Bam HI и его пригодности для генноинженерных и биотехнологических экспериментов используют реакцию рестрикции-сшивки-по- вторной рестрикции. Для этого 1 мкг ДНК фага А С1в57 инкубируют с 15 ед. эндонуклеазы Bam HI в 10 мкл 6 мМ трисНС буфере.

рН 7,5, содержащем 6 мМ MgCl2. 6 мМ /3- - меркаптоэтанол и 0,1 М NaCI, в течение 1 ч при 37° С. Реакцию останавливают прогреванием при 65° С в течение 5 мин, добавля- 5 ют 0,5 ед.акт. Т4 ДНК-лигазы и 1 мкл 300 мМ раствора АТР и инкубируют в течение 16 ч при 10° С. Затем проводят повторную рестрикцию эндонуклеазой Bam HI. Продукты каждой из этих реакций анализируют элек- 10 трофорезом в 1%-ном агарозном геле. Как видно из электрофореграммы, полученный препаратэндонуклеазы Bam HI обеспечивает полную рестрикцию ДНК фага Я с образованием фрагментов ожидаемой длины. 5 После добавления ДНК-лигазы происходит полная сшивка рестриктов. Повторная рестрикция продукта лигазной реакции приводят к образованию характерных фрагментов рестрикции. Данный тест показывает, что 0 препарат Bam HI свободен от примесей эк- зонуклеаз, фосфатаз и неспецифических эн- донуклеаз.

П р и м е р 2. Свойства экзонуклеазы B.amyloliquefaciens.

5В данном примере приведены доказательства того, что экзонуклеаза, выделенная из B.amyloliquefaciens штамм ВКПМ В-3188, действительно принадлежит к классу гидролаз К.Ф. 3.1.11.2, кроме того, указа- 0 ны ее преимущества перед экзонуклеазой III E.coli.

Определение молекулярной массы. Молекулярную массу экзонуклеазы III определяют электрофоретически в 12,5%- 5 ном полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях. Молекулярная масса фермента составляет 29 КД.

Экзонуклеазная активность. Для тестирования этой активности синтезируют сле- 0 дующий субстрат

5 -o(GpGpApTpGpApCpGpCpGpT32pC) o(ApCpGpTp CpCpTpApCpTpGpCpGpCpAp pGpCpT)

1 пмоль таких двуспиральных олигонук- 5 леотидов инкубируют с 10 нг фермента в 10 мкл 6 мМ трисНС буфере, рН 7,5, содержащем 6 мМ MgCl2 и 6 мМ / -меркаптоэтанол, в течение 30 мин при 37° С. Продукты реакции разделяют электрофорезом в 20% ПААГ 0 с 7 М мочевиной в 50 мМ трисборатном буфере, рН 8,2, содержащем 1 мМ ЭДТА. Меченые олигонуклеотиды идентифицируют с помощью радиоавтографии. При неполномгидролизеуказанного5 олигодезоксинуклеотида исследуемой нук- леазой обнаруживают только один меченый продукт реакции, который, как показано с помощью ТСХ. представляет собой 5 - Р dCMP. Из этих данных следует, что фермент

работает по экзонуклеазному механизму, так как при эндонуклеазном расщеплении среди продуктов неполного гидролиза в первую очередь обнаруживаются меченые олигонуклеотиды. Очевидно также, что нук- леаза отщепляет 5 -NMP, так как при отщеплении 3 -нуклеозид-монофосфатов 32Р обнаруживается в составе 3 - P-j dTMP.

Таким образом, выделенная нуклеаза катализирует гидролиз двухцепочных оли- годеокзсирибонуклеотидов в 3 51 направлении. Чтобы проверить является ли двуспиральная структура З4 -конца обязательным условием для проявления активности фермента, используют следующие олигодезоксинуклеотиды: d(GATCCGGGTCATCCAG) - № 1, d(AATTCTGGATGACGCG) - № 2, d(GGATGACGCG)№3,

d(TCGACGCGTCATCCTGCA) - № 4. Состав этих олигонуклеотидов позволяет получить дуплексы с идентичным средним участком и различной структурой 3 -конца d(GATCCGCGTCATCCAG) d(GCGCAGTAGGTCTTAA) (A) d(GATCCGCGTCATCCAG) d(GCGCAGTAGG)A) (Б) С G Т

d(TCGACGCGTCATCC) d(GCGCAGTAGGTCTTAA) (В) Указанные двуспиральные олигонуклеотиды инкубируют с экзонуклеазой. Результаты анализа показывают, что эффективный гидролиз имеет место лишь в том случае, если 3 -конец спарен. Если же 3 -конец олигонуклеотида свободен или расплетен, то расщепления не наблюдается. Существенно, что уже два нуклеотида, выступающие с 3 -конца (дуплекс Б, мечена верхняя цепь), делают субстрат нечувствительным к действию фермента.

Конечными продуктами реакции является нуклеозидмонофосфаты и 5-6-членные олигонуклеотиды. Наличие последних связано с тем, что олигонуклеотиды. такого размера в условиях реакции не способны образовывать двуспиральную структуру, необходимую для функционирования нуклеа- зы.

Активность РНК-азы Н. Гомогенный препаратэкзонукле азыиз

B.amyloliquefaciens способен гидролизо- вать не только двуспиральную ДНК, но и РНК в составе РНК-ДНК гибридов. РНК- ДНК гибрид получают с помощью РНК- полимеразы,20-членно г о олигодезоксинуклеотида в качестве

матрицы и пентадезоксинуклеотида d(CACTT) в качестве затравки.

5 -d(CAGTT)AGGAUCCAUUUCAC d(GTCAA TCCTAGGTAAAGTG)-5 -32Р - меченой была либо верхняя,

либо нижняя цепь гибрида.

Условия реакции и анализ продуктов такие же, как описано в случае анализа экзо- нуклеазной активности. РНК в составе 0 гибрида гидролизуется полностью. От цепи ДНК отщепляется только 3 нуклеотида, т.е. гидролиз протекает лишь на участке, где олигонуклеотид-матрица спарена с олигоде- зоксинуклеотидом-затравкой; в дуплексе с 5 РНК ДНК остается полностью интактной. В контрольном эксперименте, где в качестве сусбтрата используют двуспиральный оли- годезоксинуклеотид аналогичной структуры, обе цепи расщепляются одинаково. 0 Из всех проверенных субстратов лишь двуцепочечная ДНК и РНК в составе РНК- ДНК гибрида эффективно гидролизуется экзонуклеазой II В. amyloliquefaciens. Двуспиральные РНК, тРНК и одноцепочечная 5 ДНК устойчивы к действию нуклеазы.

АР-эндонуклеазная активность. Для выявления АР-эндонуклеазной активности у экзонуклеазы B.amyloliquefaciens используют суперспиральную ДНК плазмиды pBR 0 322, Такая ДНК, обработанная 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, в течение 1-0 мин при 70° С, содержит 2-3 апуриновых сайта на молекулу и сохраняет суперспиральную структуру. При обработке такой ДНК эндо- 5 нуклеазой, специфически расщепляющей апуриновые участки, происходит переход ДНК из суперспиральной в кольцевую форму. Такой переход легко выявить электрофорезом ДНК в 1 %-номагарозном геле, так как 0 подвижность кольцевой формы ДНК значительно меньше, чем суперспиральной.

1 мкг апуринизованной ДНК фага pBR 322 инкубируют с 10 нг экзонуклеазой III в 20 мкл 50 мМ трисНС буфере, рН 8, содер- 5 жащем 5 мМ CaCl2 и 1 мМ / -меркаптоэта- нол, при 37° С в течение 30 мин. Продукты реакции разделяют электрофорезом в 1 %- ном агарозе и окрашивают этидиум бромидом (5 мкг/мл). Показано, что при этом 0 суперспиральная ДНК количественно переходит в кольцевую форму.

З -фосфатазная активность. З -фосфа- тазную активность тестируют по увеличению затравочной активности ДНК, 5 содержащей фосфаты на 3 -конце. Такой субстрат получают, обрабатывая 200 мкг ДНК из тимуса теленка 10 мкг ДНКазы It (Sigma, США) в 200 мкл 20 мМ натрий ацетатного буфере, рн 5, в течение 20 мин при 37° С. ДНК-азу удаляют фенольной экс

тракцией, осаждают спиртом, высушивают и используют в качестве субстрата.

2 мкг ДНК, обработанной ДНК-азой II, инкубируют с 10 нг экзонуклеазы B.amyloliguefaciens в 20 мкл 20 мМ трисНС буфере, рН 7, содержащем ЮмМ MgCte, при 37° С в течение 30 мин. После этого к реакционной смеси добавляют dATP, dGTP, dCTP в концентрации 0,4 мМ, 14C-dTTP (0,1 Cl/ммоль) и 10 ед. акт. ДНК-полимеразы I. Меченые продукты реакции осаждают 10%- ной трихлоруксусной кислотой при 0° С и кислотонерастворимую радиоактивность определяют на счетчике Mark Ml (Nuclear Chicago, США). Контролем-служит ДНК, содержащая 3 -фосфаты и необработанная экзонуклеазой III. Табл.2 иллюстрирует включение 14С ТМР в ДНК, обработанную экзонуклеазой III.

Результаты убедительно показывают, что при инкубации ДНК с экзонуклеазой B.amyloliquefaciens происходит отщепление 3 -концевых фосфатных групп.

По механизму действия этот фермент аналогичен экзонуклеазе III из Escherichia coll, Hacmophilus Influenzae и Strepfococeus pneumoniae и в соответствии с рекомендациями Комисии по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB может быть отнесен к группе гидролазЗ.1.11,2. Высокая специфичность экзонуклеазы III B.Amyloliquefaclens к структуре 3 -конца субстрата является премуществом при использовании фермента для секвенирования ДНК. В основе метода секвенирования с использованием экзонуклеазы III лежит получение фрагмента ДНК, один из концов которого устойчив к экзонук- леазному гидролизу. В случае экзо-

0

5 0

5 0

0

5

нуклеазы III E. coli такой конец должен содержать не менее четырех неспаренных оснований, а при использовании фермента из B.amylollgrafaclens достаточно двух, а может и одного. Этот факт позволяет расширить спектр рестриктаз, пригодных для получения фрагмента с выступающим З -концом. Таким образом. из 100 г B.amyloliquefaciens штамм ВКПМ В-3188 получают 2,5 мг рестриктазы Bam HI с удельной активностью 493600 ед.акт./мг и 0,04 г электрофоретически гомогенной экзонуклеазы III с удельной активностью 1350 ед.акт./мг.

Формула изобретения Способ получения ферментов из биомассы Bacillus amylollquefaciens штамм ВКПМ В-3188, включающий разрушение клеток, получение клеточного экстракта, хроматографическое разделение экстракта на фосфоцеллюлозе P-II и хроматографиче- скую очистку, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты целевых продуктов и степени использования исходной биомассы, хроматографическую очистку осуществляют последовательно методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ- целлюлозе в градиенте NaCI 0-0,4 М. после чего фракции, содержащие рестриктазу Bam HI, очищают хроматографически на гидроксиапатите в градиенте фосфата калия 0,01-0,6 М и на Bio-Rex 70 в градиенте NaCI 0-1 М, фракции, содержащие экзонуклеазу III, очищают хроматографически на гидроксиапатите в градиенте фосфата калия 0,01- 0,6 М на аминогеколсефарозе в градиенте NaCI 0,14-0,18 М и на ДНК-целлюлозе в градиенте NaCI 0-1.М.

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано для получения ферментов нуклеинового обмена, в частности эндо-и экзонуклаз. Целью изобретения является повышение степени чистоты целевых продуктов и степени использования исходной биомассы. Способ заключается в том, что биомассу B. AMYLOLIGUEFACIENS штамм ВКПМ В-3188 разрушают, клеточный экстракт после хроматографии на фосфоцеллюлозе подвергают дополнительной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Фракции, содержащие активность эндонуклеазы BAM HI, подвергают очистке на гидроксиапатите и BIO-REX 70, а фракции, содержащие экзонуклеазу Ш, подвергают очистке на аминогексилсефарозе и ДНК-целлюлозе. Из 100 г биомассы получают 2,5 мг рестриктазы BAM HI с удельной активностью 493600 ед/мг и 40 мг экзонуклеазы Ш с удельной активностью 1350 ед/мг. 2 табл.

Очистка эндонуклеазы рестрикции Bam HI

Таблица 1

3 - фосфатазная активность экзонуклеазы B.amylollquefaciens ВКПМ В-3188

Субстрат для ДНК-полимеразы I

Тимусная ДНК, содержащая З -концевые

фосфатные группы

Тимусная ДНК, содержащая З -концевые

фосфатные группы, после обработки экзонуклеазой III

Таблица 2

Включение м С-ТМР в кислотонерастворимый продукт. %

2

40