Способ получения сыворотки крови птиц Советский патент 1990 года по МПК A61K35/14 

Изобретение относится к клеточной биологии и может быть использовано научно-исследовательскими и произ- водственньми ветлабораториями для приготовления по промышленной технологии в больших количествах сыворотки крови птиц для культивирования клеток животных тканей.

Целью изобретения является повышение производительности способа и улучшение качества целевого продукта.

Пример 1. Взятие крови про- водят у клинически здоровой птицы в условиях промьшшенной технологии ее убоя без помощника. Фиксацию птицы осуществляют на специальном столике в спинном положении резиновыми шлангами с помощью кровоостанавливающих

зажимов в трех местах: на теле в области грудины, обеих лапках и голов-. ке. Конец шланга, фиксирующий тело, крепится зажимом к боковой пластине столика. Концы шлангов, фиксирующих

.лапки и головку, прижимают зажимами.,

Взятие крови у птицы проводят по стериальной закрытой системе во фла- коны емкостью 250 мл. Предварительно подогретый в водяной бане (температура 37-40 С) флакон системы взятия крови устанавливают под углом 35 ° в ячейку столика для фиксации птицы. Пункцию сердца проводят следующим образом. Иглой системы для взятия крови горизонтально к плоскости сто-

, ла прокалывают кожу, предварительно обработанную спиртом, и лежащие под- ней ткани у птицы в области углубле05

со оо ;&

ия В месте разветвления ключиц, ylm ают пружинные зажимы с ватного ильтра и одного селиконового шланга, дущего к флакону, иглу в горизон - апьном положении продвигают в грудо рюшную полость до попадания в поость сердца, при попадании иглы в полость сердца рукой, в которой на-- ходится игла, всегда ощущается цебиение, и кровь, пульсируя, посту пает во флакон. Обескровленную птицу переносят на конвейер,.

Флакон заполняют кровью до его объема в два этапа;; первой иг- лой. набирают 60--75 мл крови и ставят в теплую воду (температура С) под углом 35° на Г4ин, За это время образовавпшйся сгусток крови отслаивается от поверхности стекла флакона самостоятельно или путем кого вращательного движения флакона и отделяется незначительное количест во сыворотки. Второй иглой набирают кровь до 160 85 мл и выде рживают в водяной бане при тех жэ условиях, что и на первом этапе, до отслоения сгустка крови от поверхности стекла флакона, Двухэтапное заполнение фла конов по описанной технологии обус ловливает максимальное отделение сы воротки от сгустка крови« Над плане нем спиртовой или газовой горелки удаляют пробку системы взятия крови с флакона и заменяют ее другой сте рильной пробкой

Отделение сыворотки осуществляют методом центрифугирования флаконов, заполненных кровью, при 2000- 2200 об/мин в течение- минв Вы ход сыворотки 40-50%. При хранении по производственной необходимости флаконы с кровью выдерживают до центрифугирования в воде с кусочками льда (температура 6.10 С) не более 1 .4,,

Сбор отделившейся сыворотки про водят стерильной системой для сбора сыворотки крови. Перед сбором ротки горлышки флаконов обрабатывают спиртом в Кровоостанавливающим 7-ja;i H - мом перекрьгоают селГжоновый шланг, идущий к сосуду для сбора сыворотки Над пламенем удаляют пробку с флако на с отделившейся сывороткой и дят трубку для отсоса сыворотки, не разрушая сгусток крови. Прикрывают горлышко флакона пробкой с отверсти ем, заполненным ватой. Затем в сосуде для сбора сыворотки создается от рицательное давление 0,150,2 атм с помощью разряжающего мембранного компрессора (штуцер - трубка из не ржавеющей стали). Шланг, идущий от компрессора, надевается на селиконо вую трубку ватного фильтра. Флаконы с отделившейся сывороткой ставят в слегка наклонном положении, и трубку с защитным зонтиком на всасывающем конце постепенно опускают по стенке флакона до границы раздела сыворотки и сгустка крови а Защитный зонтик на 5 всасывающем конце трубки профилакти рует попадание в сыворотку форменных элементов крови и позволяет прово дить наиболее полно ее сбор, Посред ством кровоостанавливающего зажима Q регулируют скорость отсоса сыворотки

Освобождение сыворотки от попав ших в нее форменных элементов крови проводят методом центрифугирования флаконов с собранной сывороткой при 5 1000 об/мин в течение мин.

Осаждение и удаление из сыворотки криоглобулинов проводят следующим Образом Освобожденную от форменных элементов крови сыворотку подвергают 0 глубокому замораживанию при 20 С в течение ч во флаконах емкостью 250 мл« После оттаивания (при С) в сыворотке выпадает осадок криогло булинов, который удаляют центрифу гированием флаконов с сывороткой при 1500 об/мин в течение мин

Стерилизацию сыворотки после уда ления криоглобулинов проводят мето дом фильтрации ее через набор мемб дг ранных фильтров фирмы Миллипор с диаметром пор 1,2/Ц 0,22|Ц. Сыво ротку разливают по мл и эти кируют. Расфасованную сыворотку хра нят при 4°С« После проверки на ста 45 рильность, ростовые свойства и на содержание специфических антител сы воротка -может быть использована для культивирования клеток животных тка нейе ;;р П р и м е р ,2. Сравнительное

изучение отделения сыворотки методом центрифугирования флаконов запол неннык кровью кур в один и два эта па (табла), где п число флаконов Б опыте; х среднее арифметическое; , m средняя ошибка среднего, арифмв тического).

В опыт взято 12 флаконов емкостью 250 мл, заполненных кровью до

5

их объема в одни этлп (вариант ОПЬР- та 1), и 22 флакона, гланолнепиьк кровью до 65 -75% их объема в два этапа до 25 30% яа первом этапе и до 65 75% их объема гга втором этапе (вариант опыта 2). Заполнение флаконов кровью проводится при условиях, ука занных в примере I. Отделение сыво ротки проводится методом центрифу гирования флаконов с кровью при 2000 об/мин в течение 30 мин.

Как видно из табл.1, выход сыво ротки при центрифугировании флаконов заполненных кровью в один этап, не значителе.1 10,84+1,42% к объему крови и резко возрастает до 41,51+ +1,05% при центрифугировании флаконов, заполненных кровью кур в два этапа.

Пример 3. Сравнительное изучение взятия крови из сердца кур по предлагаемому и известному способам (табл.2).

По предлагаемому способу пример проведено взятие 2,850 л крови у 16 кур с живой массой 2,,2 кг за ч 50 мин без помощника. За 1 чел/ч получено 1,550 л крови (вариант опыта 1).

По известному способу берут кровь у 6 кур с живой массой 2,5-3,9 кг. Получено 0,395 л крови за 1 ч. Взяти крови проводится с помощником, поэтому за I чел/ч получено 0,2 л кро- ви, что почти в 8 раз меньше, чем по предлагаемому способу

Как видно из табл.2, отношение взятой крови к живой массе кур по известному способу составляет лишь ,,11%, а по предлагаемому способу 5,50+0,08%.

Пример 4, Сравнительное изучение отделения сыворотки крови кур по предлагаемому и известному способам (табл. 3).

По предлагаемому способу (приме- ры I и 2) проведено отделение сыворотки методом центрифугирования фла конов емкостью 250 мл, заполненных кровью в два этапа до 65-75% их объема, при 2000 об/мин в течение ,30 мин, В опыт взято 22 флакона с общим объемом крови 3,785 л„ Выход сыворотки 1,570 л(вариант опыта 1).

По известному способу сьшоротку отделяют методом отстоя крови в стеклян кьк пробирках на 20 мл, В .опыт взято

396

16 пробирок, 15. каждую из которых Hii

лито по 13 мл крови. Общий объем кро ви в пробирках 0,240 л. Время отстоя 5 ч. Выход сыворотки 0,04 l л,.

Из табл.3 видно, что выход сыво- ротки по предлагаемому способу ее отделения достаточно велик; в среднем из одного флакона отсосано 71,36+. , l,95 мл сыворотки крови. Чтобы получить такое количество сыворотки по известеому способу необходимо заполнить кровью пробирок, что свидетельствует о низкой технологичности и незначительном отделении сыворотки от сгустка

Пример 5. Сравнительное изучение ростовых свойств сывороток крови кур, крупного рогатого скота и эмбрионов коров при культивировани клеток РК-15 (табл.4).

Перевиваемая линия клеток РК - 15 получена из почки поросенка, завезена из Португалии и поддерживается на среде, состоящей из 90% среды Игла МЕН с глутамином и 10% сыворотки крови эмбрионов коров. Посев клеток РК -15 проводят в стеклянные матрасики емкостью 200 мл. В каждый матрасик вносят по 30 ьш клеточной взвеси в культуральной питательной среде с концентрацией 54,22+1,07 тыс клеток/мл. Посевная доза на 1 матрасик 1626,65+32,05 тыс.клеток. Состав культуральной питательной среды: 90-98% среды Р1гла MEM с глутамином, 2-10% сыворотки крови кур, каннами- цина сульфата из расчета О, 1 мг/мл.. Клетки помещают в термостат при 37 С.

В качестве контроля служат клетки РК-15, выращенные при тех же условиях в присутствии сывороток крови крупного рог атого скота и их эмбрионов, которые получены на базе Казанского мясокомбината. Оценку роста клеток в динамике проводят по индексу пролиферации

Из табл.4 следует, что лучшие результаты по индексу пролиферации получены при 5%-ной концентрации сы воротки крови в культуральной питательной среде. Индекс пролиферации клеток РК-15, выращенных в присутствии 5% сыворотки кур, через 96 ч роста выше (4,92), чем в присутствии сыворотки крови крупного рогатого

скота (3,59) и сыворотки крови эмб рионов коров (4,03).

Культура клеток при указан ной посевной концентрации клеток, выращенная на среде Игла MEM с сыворотки кур при исследовании под :микроскопом через ч образует гтлотный, хорошо выраженный монослой, клетки несколько крупнее, чем в при :сутствии сыворотки эмбрионов коров,, но не теряют четкости границ, прО Мрачности и конфигурации. При куль- Ьгивировании этих клеток на среде, со |д€ржащей сыворотку кро ви крупного ро IraToro скота, клетки образуют тяжи,, теряют четкость границ и прозрачность

И 1 и м е р 6. Сравнительное изу чение ростовых свойств сывороток кро :ви кур, крупного рогатого скота и : эмбрионов коров при культвировании ;клеток ПЭК (первично трипсинизирован ных клеток почек эмбриона коровы).

Трипсинизацию почек эмбриона (до 1,5 кг) коровы проводят по известной методике. Суспензию этих клеток вносят в стеклянные матрасики емкостью 200 мл по 30 мл с концентрацией 500000 клеток/мл. Состав культураль ной среды: 95% среды Игла MEM с глу тамином, 5% сыворотки крови кур, каннамицина сульфата из расчета 0,1 мг/мл.- Клетки помещают в термо стат при 37°С. Смену среды проводят через 24 ч после посева клеток.

Контролем служат эти же клетки, выращенные при -тех же условиях в к ультуральной питательной среде со става: 90% среды Игла MEM с глутами ном, 10% сыворотки крови крупного

рогатого скота или их эмбрионов, кан намицин сульфата из расчета 0,1 мг/мл1

Клетки ПЭК в присутствии сыворот ки крови кур и эмбрионов коров обра зуют полный монослой через 72 ч, а в присутствии сыворотки крови круп ного рогатого скота через 96 ч после их посева. При световом микроскопиро вании существенных различий в морфо логии клеток ПЭК, выращенных в при сутствии сыворотки крови кур и эмб рионов коров, не обнаружено, а у кле-- ток, выращенных в присутствии сыво ротки крови крупного рогатого скота, отмечена незначительная стертость границ.

Формула изобретения

Способ получения сыворотки крови птиц, включающий фиксац1-;ю птицы на столике, взятие крови из сердца иг лой в сосуд, отделение сыворотки, центрифуги1)ование ее, освобождение от криоглобулинов . и стерилизацию, отличающийся тем, что, с Целью повышения производительности способа и улучшения качества целево го продукта, фиксация птицы произво дится наклонно в желобообразном сто лике, взятие крови проводят асептически последовательно двумя иглами, вначале одной иглой до заполнения объема сосуда, затем выдержи вают кровь при 37 40 С и второй иг лой Заполняют сосуд до объема, отделение сыворотки осуществляют центрифугированием и отсасыванием, а стерилизацию проводят путем мемб ранной фильтрации.

Изобретение относится к клеточной биологии и может быть использовано в промышленной технологии получения сыворотки крови птиц для культивирования клеток животных. Целью изобретения является повышение производительности способа и улучшение качества целевого продукта. Кровь забирают из сердца птицы асептически двумя иглами последовательно: одной - до заполнения 25-30% объема сосуда, затем выдерживают при 3740°С и другой иголой - до заполнения сосуда на 65-75% объема. Затем отделяют сыворотку центрифугированием, освобождают от гемоглобулинов и стерилизуют путем мембранной фильтрации. Производительность способа увеличивается в 8 раз, выход сыворотки - в 2,5 раза. 4 табл.

т

Количест во флако

...

п

12 22

Объем крови во

флаконах, мл

175,83+1,61 Л72,,20

аблица 1

j Отношение отсосан.

ной сыворотки к „й& Ьему к|эовИд %, Х± m

10,84+1,42 41 ,51±1,05

«ff 4i yo ol ариантпыта

1 2

Количест во кур,шт

П

16 6

Живая масса кур, кг

га

3,237+0,141 3,200iO,203

1611339

10 Таблица 2

ем взятой крови 1 куры, мл

Х+ m

178,13+8,54 65,83+6,67

Отношение взятой кро ни к живой массе кур,%

Х+ m

,50+0,08 1,98+0,11

Т а .6 л и ц а 3

Таблица 4

Индекс пролиферации

(. :7-.Я.Л. НЯЯЙШ. 1 чКоличество посеянных клеток

n

161 1339

Примечание:

СКК - сыворотка крови кур; СККРС крупного рогатого скота; СКЭК эмбрионов коров

11

Продолжение табл.4

сыворотка крови сьшоротка крови