Штамм культивируемых гибридных клеток животных МUSмUSсULUS L - продуцент моноклональных антител против фактора Н @ эритроцитов крупного рогатого скота Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретеиие относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано для идентификации антигена группы крови Ы1 па эритроцитах быка.

Цель нзоОретения - получение штампа культивируемых клеток, продуцирун- njtx моноклональные антитела (монАт) .против антигена II эритроцитов быка,

Цтамм получают следующим образом„

Клетки мышиной пиеломы Sp 2/0, устойчивой к иг/мл бромистого эгидия (Ьр EBR-5) , гиОридируют с по- моцью ПЭГ 1000 с клетками селезенки мыши линии Balb/c, иммунизированной

эритроцитами быка, несущими антигенный фактор II4 наряду с другими Схема иммунизации: 107 эритроцитов/мышь внутрибрюшинно (в/б) - интервал 21 день - 5x105 эритроцитов/мыль в/б - через 4 дня мыль забивают„

В результате тестирования полученных гибридных культур по признаку продукции антител против антиге на Н и последующего их клонирования отбирают птамм, продуцирующий монАТ против антигенного фактора Н . Клетки данного штамма прививают мышам линии Balb/c и получают асцит,

СП

ьз

со

3

используемый в качестве реагента для типирования эритроцитов по антигену 11 о

Полученный штамм хранится в Спе- циализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(И) K«264D.

Культуральные свойства.

Итамм культивируют на ростовой среде Игла в модификации Дальбекко (ДНЕМ) с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, а также 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глугамина, 2-мер- каптоэтанола и 40 ед„/мл гентамици на о

Культивирование проводят при 37 С

в инкубаторе с содержанием 5-8% CQj или в герметических флаконах в тер- мостате без подачи CO«0 Способ культивирования суспензионный Кратность рассева 1:3 при пересеве через 48 ч„ Посевная доза клеток-150 тыс .клеток/мл, а максимальная плотность популяции 600 тыссклеток/мл. При росте на указанной среде клетки птамма имеют округлую формус Время удвоения популяции 36 ч„ Клонирование клеток проводят в 96 ячеечных платах предельным разведением с использованием в качестве фидерного слоя макрофагов мышей При посеве 3-4 клеток в лунку эффективность клонирования 70%.

Криоконсервацию проводят в сыво- ротке эмбрионов коров с добавлением 10% диметилсульфоксида (ДМ80) при концентрации 1x10 клеток/мл. Жизнеспособность клеток при размораживании 75-80%.

Прививка клеток штамма D 264 син- генным мышам вызывает у них образование асцитной опухоли, сопровождающейся выделением асцитной нидкости в количестве от 1 до 8 мл. В асцитной жидкости содержатся специфические монАТ к Н - антигенному фактору крови быка о Способность в продукции монАТ клеткам птамма D 264 сохраняет- ся на протяжении трех месяцев непрерывного культивирования клеток. После размораживания клеток способность продуцировать монАТ сохраняется,, Прививка мылам птамма на разных пассажах культивирования стабильно вызывает (образование асцитных опухолей у мышей с высоким титром монАТ в асцитной жидкости.

Для кариологического анализа клеток штамма D 264 используют 100 мета- фазных пластинок хромосом. Модальный класс не выражен, разброс хромосом от 47 до 113; 22% от обцего числа проанализированных шгеток (п 100) имеют количество хромосом от 96 до 100., В 50% клеток встречаются центромер-поло- яительные минихромосомы в количестве 1-3 на геном.,

Характеристика ионАТ, продуцируемых птаммом D 264 о

Специфичность полученных MICA определяют с помощью стандартного серологического теста гемолиза„ Анализ проводят на панели эритроцитов, состоящей из 120 образцов крови КРС, у которых заранее определяют антигенную структуру по группам крови с помощью моноспецифических аллоантисывороток„ Полученные монАТ проявляют специфичность, аналогичную моноспецифической сыворотке антн-11

МонАТ принадлежит к классу IgG по данным молекулярных весов цепей, определяемых методом электрофореза

Продуктивность клеток штаммаD264„

При культивировании клеток штамма D 264 в MI плах линии Balb/c от одной мыли получают от 1 до 8 мл асцитной жидкости (в среднем 4 мл)„ Титр антител в асцитной жидкости, установленный с помоцью гемолиза эритроцитов КРС микрометодом, составляет 10 „

Использованием штамма поясняется примером идентификации с помощью монАТ D 264 антигена Н1 на эритроцитах коров методом реакции гемолиза

Пример Исследуют эритроциты от 120 животныхс В качестве сравнения для типирования эритроцитов применяют специфическую аллоантисыворотку против антигена Н. Готовят индивидуальные суспензии эритроцитов КРС, кровь из яремной вены крупного рогатого скота отбирают в пробирки со стандартным антикоагулируюпим раствором, эритроциты 4 раза отмывают 0,08%-ным раствором хлористого натрия путем последовательного центрифугирования и разбавления (10 мин, 2000 об/мин), приготовляют 2,5%-ную суспензию эритроцитов в 0,08%-ном растворе хлористого натрияо Затем в 96-ти ячеечных планшетах для иммунологических реакций (пр-ва СССР) смешивают 20 мкл асцитной жидкости в 20 мкл суспензии эритроцитов. Полученэ164

ную смесь шЈкубнруют при в течение 30 мин и добавляют 50 мкл кроличьего комплемента, затем

снова инкубируют в течение одного часа при 37 С и оценивают гемолиз по четырех балльной системе Анализ показал, что монАТ D264 вызывают гемолиз только тех эритроцитов, которые наряду с, другими, несут антигенный фактор Н и не реагируют с эритроцитами, не содержащими антигенный фактор Н .

Для установления титра монАТ ас- цитную жидкость разводят 0,08%-ным раствором хлористого натрия и опре- деляют максимальное разведение, при котором она еце способна вызывать гемолиз эритроцитов КРС0 С этой целью использовали указанный метод постановки реакции гемолиза Уста- новлено, что полученные монАТ вызы

вают гемолиз эритроцитов, несущих антигенный фактор Н , вплоть до

разведения 1:10 „

Таким образом, в результате использования предлагаемого изобретения получен реагент, позволяющий ти пировать коров с Н -антигенным фактором в S-системе групп крови. Реагент по активности (титру антител 10) в 30 тыс„ раз превышает стандартный препарат (титр 1:32).

Формула изобретени

Ытаим культивируеьых гибридных клеток животных MUS MUSCULUS L. BCKK(II) К 264 D - продуцент моно- клональных антител против фактора II эритроцитов крупного рогатого скота„

Изобретение относится к гибри- домной технологии и может быть использовано для идентификации антигена группы крови Н на эритроцитах быка Цель изобретения - получение штамма культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) против антигена II1 эритроцитов быка. Штамм получают гибридизацией клеток пиеломы Sp2/0 (сублииин SpEBR-5) с клетками селезенки мыиеи Balb/c, им- муни-jHpoванных эритроцитам быка Штамм культивируют в среде ДНЕМ с 10% сыворот си эмбриона коровы и стандарт- ными добавка П1 Клетки пересевают 1:3 каждые 48 ч с начальной концентрацией 1,. Утамм прививается с.ннген- ным мьпдап в виде асцитной опухо Ш, Ытамм продуцирует монАТ класса IgGk Взаимодействие монАТ с 3pnTpou«Tahm оценивают в реакции комплементзависи- мого гемолиза. Титр монАТ в асцитной жидкости в данной реакции 10 „ Итамм депонирован под номером ВСКК(П) № 264D,s Ј (/