СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА Российский патент 2003 года по МПК A61K39/255 C12N7/00 C12N7/00 C12R1/92 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и предназначено для получения стандартизированного препарата для профилактики болезни Марека. В основу изобретения положена отработка технологии синхронного культивирования вируса герпеса индеек (ВГИ) в фибробластах эмбрионов перепелов (ФЭП) и вируса герпеса кур (ВГК) в фибробластах эмбрионов кур (ФЭК).

Болезнь Марека (БМ) - высококонтагиозное, лимфопролиферативное, злокачественное, вирусное заболевание птиц. БМ регистрируется во всех странах мира, где развито промышленное птицеводство, в том числе и в нашей стране, вызывая большие экономические потери. Болезнь характеризуется образованием единичных (в начальной стадии) и множественных опухолей во внутренних органах, коже, мышцах, а также изменениями центральной и периферической нервной системы. Вирус болезни Марека (ВБМ) повреждает иммунокомпетентные органы (селезенку, тимус, клоакальную сумку) и обладает таким образом иммунодепрессивной активностью, что приводит к снижению общей резистентности птиц и повышению их чувствительности к другим болезням. В связи с этим БМ довольно часто протекает в ассоциации с другими заболеваниями. Важным средством предупреждения БМ и снижения потерь от заболевания является вакцинопрофилактика. Для специфической профилактики используют живые вакцины трех типов: из аттенуированных штаммов ВБМ (серотип 1), из природно-ослабленного непатогенного ВБМ (серотип 2) и из штаммов вируса герпеса индеек (ВГИ, серотип 3). Серотип 1 включает все онкогенные вирусы и аттенуированные варианты ВБМ, серотип 2 - все природно-ослабленные ВБМ, серотип 3 - антигенно родственные ВБМ вирусы герпеса индеек.

Известен способ получения поливалентной вакцины против БМ, содержащей смесь суспензий клеток ФЭК инфицированных штаммом "FC-126" ВГИ третьего серотипа и штаммами "42" и "50" ВГК второго серотипа [1].

Недостатком данного способа является то, что для получения готовой продукции приходится поддерживать три штамма вируса, которые культивируются различное время.

Известен способ изготовления вакцины из штаммов третьего серотипа ВГИ "ВНИИЗЖ 110 ДЭП" [2].

Недостатком данного способа является то, что препарат выпускается в двух дозировках, время культивирования вирусов различное. Использование пяти пассажей может привести к нестерильности конечного продукта, запассированию вирусов с последующей потерей иммуногенности.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения бивалентной вакцины БИМАРЕК форте (производитель Ломан Анимал Хэлс, Германия), который изготавливается из штаммов "FC-126" и CVI-988 [3].

Недостатком данного способа является выпуск нестандартной готовой продукции в малой фасовке (0,9 см³) с высокой инфекционной активностью вирусов, не обеспечивающих достаточную защиту птицы от БМ. Кроме того, технология производства вакцины БИМАРЕК форте предусматривает допосадку (дополнительной дозы культур клеток и дополнительной дозы вируса).

Целью настоящего изобретения является разработка способа изготовления стандартной, обладающей стабильной инфекционной и иммуногенной активностью бивалентной вакцины против БМ.

Поставленная цель достигается синхронным культивированием двух штаммов на разных культурах; подготовкой матровых расплодок с постоянной активностью; использованием для заражения разных культур ФЭП и ФЭК; постоянной заражающей дозой для каждого вируса; постоянным временем культивирования вируса на ФЭП и ФЭК; использованием в качестве поддерживающей среды смеси следующего состава, мас.%:
Среда 199 - 70-90
Среда МЕМα - 10-30
синхронным снятием вирусов с ФЭП и ФЭК, объединением двух вирусов для получения готовой вакцины: 2 см³ ВГИ и 1 см³ ВГК; использованием в качестве защитной среды смеси следующего состава, мас.%:
Среда 199 - 58-75
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 8-25
Диметилсульфоксид (ДМСО) - 7-10
расфасовкой готовой вакцины по 3 см³ с содержанием в одной прививочной дозе 1000 ФОЕ ВГИ или 100-300 ФОЕ ВГК.

Получение стандартной бивалентной вакцины достигается:
- культивированием клеток ФЭК и ФЭП с постоянной посадочной концентрацией: для ФЭП - 1,5 млн/см³, для ФЭК 1,2 млн/см³ в течение 48 часов;
- заражением полученного клеточного монослоя постоянной заражающей дозой вируса: для ФЭП - 700 тыс. ФОЕ/бутыль, для ФЭК 100 тыс. ФОЕ/бутыль с содержанием в прививной дозе вакцины (0,2 см³) 100 или 300 ФОЕ в зависимости от эпизоотической ситуации в птицехозяйствах;
- культивированием зараженного монослоя ФЭП и ФЭК в течение 48 часов;
- синхронным съемом зараженных ФЭП и ФЭК и получением конечного продукта с постоянной концентрацией клеток в 1 см³.

Культивированием штамма 3 серотипа на ФЭП достигается положительное влияние на приживляемость и репродукцию основного компонента бивалентной вакцины в организме цыпленка.

Проведение одного пассажа в процессе перепассирования предложено во избежание потери иммуногенности при изготовлении промышленных серий вакцины.

В предлагаемом способе применение штаммов 2 серотипа, который репродуцируется в организме птицы, позволяет использовать привитую птицу, начиная с 90 дня до конца промышленного цикла, тогда как применение штаммов 1 серотипа в БИМАРЕК форте вакцине - только со 120 дня.

Содержание 2 см³ ВГИ в целевом продукте с титром 5,0-6,0•10⁵ ФОЕ/см³ является оптимальным для получения стандартных серий вакцины, обеспечивающих иммуногенную защиту птицы в 80-85% случаев.

Использование менее 2 см³ ВГИ в целевом продукте приводит к получению нестандартного препарата. При добавлении более 2 см³ ВГИ в целевой продукт не происходит значительного увеличения иммуногенной защиты птицы.

Компановка вакцины в соотношении вирусов ВГИ и ВГК 1:10 дает возможность данным штаммам репродуцироваться в организме цыпленка с выработкой специфического иммунитета до конца промышленного использования птицы.

Добавление в поддерживающую среду среды МЕМα в кол-ве 10-30 мас.% обеспечивает клетку азотистыми основаниями и дополнительным количеством аминокислот, что в конечном итоге позволяет получать вируссодержащие клетки при минимальном разрушении и сохранять их при съеме и глубокой заморозке.

Использование защитной среды следующего состава, мас.%:
Среда 199 - 50-75
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 8-25
МЕМα - 10-15
ДМСО - 7-10
позволяет обеспечить организм цыпленка в первые сутки жизни сбалансированным набором витаминов, заменимых и незаменимых аминокислот.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Для изготовления бивалентной вакцины против БМ используют 9-10-суточные свободные от патогенной флоры (СПФ) эмбрионы перепелов и 10-12-суточные СПФ эмбрионы кур, из которых готовят культуры ФЭП и ФЭК. Для выращивания первичных культур ФЭП и ФЭК применяют трипсин, солевой раствор Хенкса или Эрла, среду Игла, среду МЕМα, среду 199, среду ГЛА, сыворотку крупного рогатого скота, ДМСО.

Культуру ФЭП выращивают в течение 48 часов, либо на ростовой среде состава, мас.%:
Среда Игла - 45-75
Среда ГЛА - 15-45
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 7-10
либо на ростовой среде следующего состава, мас.%:
Среда Игла - 85-90
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 10-15
Культуру ФЭК выращивают в течение 48 часов на ростовой среде следующего состава, мас.%:
Среда Игла или среда 199 - 85-90
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 10-15
Через 48 часов культуру клеток ФЭП заражают ВГИ 100 или 300 тысяч ФОЕ/бутыль и культивируют в течение 48 часов в поддерживающей среде Игла, или в среде следующего состава, мас.%:
Среда Игла - 40-50
Среда 199 - 40-60
Культуру ФЭК через 48 часов заражают ВГИ 10-100 тысяч ФОЕ/бутыль и культивируют в течение 48 часов в поддерживающей среде следующего состава, мас.%:
Среда 199 - 70-90
Среда МЕМα - 10-30
Через 48 часов при поражении клеточного монослоя ВГИ 50-70%, а ВГК 30-50% клетки обрабатывают 0,25% раствором трипсина и снимают в защитную среду следующего состава, мас.%:
Среда 199 - 50-75
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 8-25
Среда МЕМα - 10-15
ДМСО - 7-10
Вируссодержащие суспензии ВГИ ФЭП и ВГК ФЭК объединяют из расчета 2 см³ ВГИ и 1 см³ ВГК, расфасовывают в стерильные маркированные ампулы, запаивают, замораживают, помещают в жидкий азот. Полученная вакцина представляет собой замороженную суспензию желто-розового цвета, при разбавлении разбавителем представляет собой гомогенную взвесь. Срок годности бивалентной вакцины при условии хранения ее в жидком азоте 24 месяца. (Бивалентный вирус-вакцина предназначен для использования с профилактической целью для вакцинации цыплят. ) Контроль готовой продукции осуществляют согласно ТУ 9384-032-00482909-00. Титр ВГИ 5•10⁵ - 6•10⁵ ФОЕ/см³, а титр ВГК - 1•10⁵ - 3•10⁵ ФOE/см³.

Предлагаемый способ характеризуется следующими примерами.

Пример 1
Бивалентную вакцину готовили следующим образом.

Для получения первичных культур клеток использовали эмбрионы перепелов 9-суточного возраста для культивирования штамма ВГИ и эмбрионы кур 12-суточного возраста для культивирования штамма ВГК. Эмбрионы разделывали в асептических условиях и промывали 5 раз раствором Хенкса, содержащим по 200 Ед/см³ пенициллина и стрептомицина. После этого эмбрионы помещали в плоскодонную емкость объемом 1-2 дм³ и заливали теплым (37^oС) 0,25% раствором трипсина в соотношении ткани и жидкости 1:5. Емкость устанавливали на термостатирующую магнитную мешалку на 35 минут. Емкость снимали с магнитной мешалки, жидкость фильтровали в центрифужный флакон, в который добавляли 2% к объему жидкости сыворотки крови крупного рогатого скота для нейтрализации действия трипсина. Отфильтрованную клеточную суспензию немедленно центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования трипсин сливали, а к клеточному осадку добавляли питательную ростовую среду в объеме, равном удаленному трипсину, и энергичным встряхиванием ресуспендировали. Полученную клеточную суспензию фильтровали. Фильтр промывали ростовой средой в объеме 200 см³. Концентрация данной суспензии составила около 10 млн клеток/см³. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Концентрированную суспензию клеток ФЭП разводили ростовой средой следующего состава, мас.%:
Среда Игла - 45
0,5% раствор среды ГЛА на растворе Хенкса - 45
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 10
до посевной концентрации 1,5 млн клеток/см³ для бутылей и 0,7 млн клеток/см³ для 50 мл флаконов, используемых для титрования вакцинного вируса, и расфасовывали по емкостям.

Концентрированную суспензию клеток ФЭК разводили ростовой средой следующего состава, мас.%:
Среда 199 - 90
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 10
до посевной концентрации 1,2 млн клеток/см³ для бутылей и 0,6 млн/см³ для 50 мл флаконов, используемых для титрования вакцинного вируса, и расфасовывали по емкостям. Бутыли помещали в термальную комнату на роллер при температуре 37,5^oС и вращали со скоростью 10 об/мин. Для заражения вирусами использовали 48-часовой монослой клеток ФЭП и ФЭК.

Поддерживающей средой для культивирования ВГИ являлась среда следующего состава, мас.%:
Среда Игла - 75
Среда ГЛА - 25
а для культивирования ВГК использовалась поддерживающая среда следующего состава, мас.%:
Среда 199 - 80
Среда МЕМα - 20
рН поддерживающей среды 7,4-7,6.

Для изготовления производственной серии вакцины использовали вирус маточной расплодки, проверенный на стерильность, безвредность, отсутствие контаминации чужеродными вирусами и микоплазмами и имеющий активность: для ВГИ 3•10⁵ ФОЕ/см³, для ВГК - 1•10⁴ ФОЕ/см³.

Изготовление производственной серии вакцины включало раздельное культивирование зараженных монослоев ФЭП и ФЭК, съем и формирование серий вакцины, замораживание клеток и контроль качества готовой продукции.

Для заражения клеточного монослоя ФЭП и ФЭК ампулы с матровыми расплодками доставали из жидкого азота и немедленно помещали в 3% раствор перекиси водорода с температурой 27^oС до полного размораживания. В клеточном монослое ФЭП и ФЭК проводили замену ростовой среды на поддерживающую и вносили в двадцать бутылей с монослоем культуры клеток ФЭП вирус ВГИ в дозе 300000 ФОЕ/бутыль, а в 10 бутылей с мнослоем культуры клеток ФЭК - вирус ВГК в дозе 10000 ФОЕ/бутыль. Бутыли с зараженными монослоями помещали в термальные комнаты на 48 часов. К моменту сбора вируса типичные цитопатические действия (ЦПД) в виде фокусов были отчетливо видны под микроскопом для ВГИ 50-70%, а для ВГК 30-50% поражения монослоя. Из бутылей удаляли поддерживающую среду и вносили подогретый до 37^oС 0,25% раствор трипсина из расчета 120 см³ на бутыль. Монослой смачивали раствором трипсина в течение 3 минут, затем его быстро удаляли, а бутыли помещали в термальную комнату на 15 минут. По истечении времени в бутыли вносили защитную среду следующего состава, мас.%:
Среда 199 - 65
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 15
Среда МЕМα - 10
ДМСО - 10
Для составления производственной серии бивалентной вакцины объединяли 2 см³ ВГИ на ФЭП и 1 см³ ВГК на ФЭК (из расчета их содержания в одной ампуле) в трехлитровой плоскодонной колбе со стерильным магнитом и при постоянном перемешивании вносили постепенно ДМСО. Полученную суспензию разливали по 3 см³ в предварительно маркированные ампулы, закрывали стерильной ватой, запаивали в пламени газовой горелки и замораживали методом постепенного понижения температуры в аппаратах "PLANER-R-203/R".

Данные контроля качества вакцины приведены в таблице 1.

Титр ВГИ составил 5•10⁵ ФОЕ/см³, а титр ВГК 1•10⁵ ФОЕ/см³. За одну прививную дозу принимали 1000 ФОЕ ВГИ и 100 ФОЕ ВГК.

Пример 2
Выполняли аналогично примеру 1. Изменяли только заражающую дозу монослоя ФЭК. Она составляла 100000 ФОЕ/бутыль. Данные контроля качества приведены в таблице 2. Титр ВГИ составил 5•10⁵ ФОЕ/см³, а титр ВГК 3•10⁵/см³. За одну прививную дозу принимали 1000 ФОЕ ВГИ и 300 ФОЕ для ВГК. Применение такой вакцины целесообразно в неблагополучных птицехозяйствах.

Как видно из таблиц 1, 2, вакцины всех 12 серий имели одинаковое количество клеток в 1 мл и одинаковую инфекционную активность, т.е. являлись стандартными.

В таблице 3 приведены данные сравнения эффективности вакцинации цыплят против болезни Марека различными вакцинными штаммами в остром опыте. Данные таблицы свидетельствуют о достаточно высокой иммуногенной активности бивалентной вакцины, изготовленной по предлагаемому способу (66%), тогда как эффективность вакцинации вакциной из ВГИ составляет 34,7%, а при применении вакцины с использованием пятого пассажа матрового штамма эффективность вакцинации отсутствует.

Иммуногенная активность бивалентной вакцины, полученной по данному способу, была испытана в птицехозяйствах Воронежской области. Протоколы испытаний прилагаются.

Как видно из протоколов, результаты вакцинации цыплят бивалентной вакциной положительные, а по некоторым параметрам, таким как выход деловой молодки, сохранность, среднесуточный прирост, выбраковка, поголовье цыплят, вакцинированных бивалентной вирусвакциной против БМ из ВГИ и ВГК, имеет лучшие показатели по сравнению с контрольной группой цыплят, вакцинированных поливалентной вирусвакциной, изготавливаемой в настоящее время Курской биофабрикой.

Источники информации
1. Патент России 2059414, A 61 K 39/255, 10.05.1996 г.

2. Патент России 2144377, A 61 K 39/255, 28.06.1999 г.

3. Witter R.L. et al. Avian Pathol, 1984, 13, 75-92, 133-136.

Заявлен способ получения бивалентной вакцины против болезни Марека. По предлагаемому способу штамм 3 серотипа культивируется на фибробластах СПФ эмбрионов перепелов, а штамм 2 серотипа культивируется на фибробластах СПФ эмбрионов кур. ФЭП и ФЭК инфицируются матровыми производственными расплодками вирусов без предварительного их освежения пассированием. Целевой продукт получается путем объединения 2 см³ штамма ВГИ и 1 см³ штамма ВГК. Вакцина обладает стабильной инфекционной и иммуногенной активностью. 5 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения бивалентной вакцины против болезни Марека, включающий инфицирование вирусами герпеса кур и герпеса индеек культур клеток, раздельное культивирование штаммов вируса герпеса кур 2 серотипа и герпеса индеек 3 серотипа, сбор вируссодержащей суспензии клеток с последующим их объединением, добавление криопротектора и получение целевого продукта, отличающийся тем, что инфицируют фибробласты эмбрионов перепелов ФЭП и фибробласты эмбрионов кур ФЭК матровыми производственными расплодками вирусов без предварительного пассирования непосредственно после размораживания, культивирование проводят синхронно - штамм вируса герпеса индеек 3 серотипа культивируют на фибробластах эмбрионов перепелов ФЭП, а штамм вируса герпеса кур 2 серотипа на фибробластах эмбрионов кур ФЭК. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получают целевой продукт путем объединения 2 см³ штамма ВГИ и 1 см³ штамма ВГК. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что активность вирусов стандартизирована и целевой продукт содержит ВГИ с биологической активностью 5,0•10⁵ ФОЕ/см³ и ВГК с биологической активностью 1,0•10⁵ФОЕ/см³. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что активность вирусов стандартизирована и целевой продукт содержит ВГИ с биологической активностью 5,0•10⁵ ФОЕ/см³ и ВГК с биологической активностью 3,0•10⁵ФОЕ/см³. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для культивирования вируса ВГК используют поддерживающую среду следующего состава, мас. %:
Среда 199 - 70-90
Среда МЕМα - 10-30
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что готовую вакцину замораживают в защитной среде следующего состава, мас. %:
Среда 199 - 50-75
Среда МЕМα - 10-15
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 8-25
Диметилсульфоксид - 7-10