Способ получения сыворотки крови животных для культивирования клеток животных тканей Советский патент 1993 года по МПК C12N5/00 A61K35/14 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии для культивирования линий кле- ток.животных тканей и гибридом.

Целью изобретения является упрощение способа, снижение концентраций ингибиторов роста культур клеток и повышение ростовых свойств сыворотки крови животных, превосходящей по своим показателям сыворотку крови эмбрионов коров.

Поставленную цель достигают более полным удалением ингибиторов роста Культур клеток, содержащихся в нативной сыворотке крови животных, например, тяжелых фракций белка, остаточного гемоглобина, общих липидов и холестерина, путем заморозки сыворотки при (-15) - (-20)°С е последующим оттаиванием ее при плюсовой (комнатной) температуре, в результате чего сыворотка в емкостях расслаивается, происходит своего рода фракционирование высоте столба: верхние слои ее светлые, легко подвижные, а у дна емкости слои сыворотки темно-красные, маслянистые, трудно подвижные, далее проводят сбор светлых

Слоев сыворотки крови до границы ее гемо- лизированных фракций, а затем стерилизацию через миллипоровые фильтры.

; Сущность изобретения заключается в том, что ингибиторы роста культур клеток из сыворотки крови животных удаляют путем Заморозки с последующим оттаиванием, приводящим красслоению сыворотки на от- дельные фракции, и сбора верхних светлых слоев сыворотки (до 80 - 90%) до границы ее гемолизированных фракций, стерилизации отделенной сыворотки через миллипоровые фильтры.

Для четкого представления цели изобретения в табл. 1 приведены концентрации ингибиторов роста культур клеток и других качественных показателей в цельной естественной сыворотке крови взрослого крупного рогатого скота по ТУ 49.24 6-82 и в нативной сыворотке эмбрионов коров по ТУ ФС 42-7ВС-85, утвержденным Минздравом СССР 4 апреля 1985 года, последняя из которых .считается лучшей для культивирования клеток животных тканей (прототип 2)

ел С

00 Сл

ч со

О)

Пример 1. Изучение ряда физико-химических показателей нативных сывороток крови кур. бычьей и эмбрионов коров, полученных на базе Казанского мясокомбината.

При изучении физико-химических характеристик нативных сывороток крови животных: определение общего белка, свободного гемоглобина, общих липидов, в том числе общего холестерина, прозрачности и рН установлено, что концентрации в них свободного гемоглобина, общих липидов, в том числе общего холестерина, значи- тельно превышают предъявляемые требования к сывороткам крови для кулйти- вирования клеток. Это касается также и на- тивной сыворотки крови эмбрионов коров, что можно видеть в табл. 2.

Пример 2. Сыворотки крови кур, бычков и эмбрионов коров, полученные по предлагаемому способу (ПСКК, ПСКБ и ПСКЭК) из соответствующих нативных сывороток (СКК, СКВ и СКЭК).

Способ получения.

Технологический процесс по предлагаемому способу включает одну заморозку нативных сывороток крови при (- 15) - (-20)°С в течение 24 - 48 ч с последующим оттаиванием их при комнатной температуре, сбор светлых слоев сывороток, начиная сверху, до границы раздела их с гемолизированны- ми фракциями, стерилизующую фильтрацию и контроль качества полученных сыворбток. Если сыворотка заморожена в большой бутыли, то после нескольких часов выдержки при комнатной температуре, ее для более быстрого оттаивания помещают на ночь в термальную комнату при 37°С.

Для данных опытов использованы на- тивные сыворотки крови кур, бычков и эмбрионов коров серии 4 - 88, полученные в лаборатории ВНЙВИ при Казанском мясокомбинате, Из них, соответственно, удалено 1,5 ч. (15%), 2 ч. (20%) и 1 ч. (10%) по объему нижних гемолизированных фракций сывороток после их оттаивания.

Физико-химические показатели сывороток крови, полученных по предлагаемому . способу.

С использованием общепринятых мето- до в в сыворотках крови по предлагаемому способу и нативных сыворотках определены концентрации общего белка, свободного гемоглобина, общих липидов, в том числе общего холестерина, а также прозрачность и рН. Данные результаты приведены в табл. 3,

Из табл. 3 видно, что концентрации общего белка, свободного гемоглобина, общих липидов, в том числе общего холестерина, в сыворотках крови, приготовленных по предлагаемому способу, значительно ниже, чем в нативных сыворотках крови; у них

улучшается прозрачность, а рН несколько возрастает. В целом об основных физико- химических показателях сывороток крови, полученных по предлагаемому способу, можно сказать следующее: концентрация

общего белка в 1.19 - 1,51, свободного гемоглобина в 1,54 - 2,31, общих липидов в 1,84 - 2,06, общего холестерина в 1,74 - 2,74 раза меньше, чем в нативных сыворотках крови животных.

Фракционный состав белков у сывороток крови, приготовленных по предлагаемому способу, в сравнении с нативными сыворотками крови животных.

Проведен электрофорез сывороточных

белков в пластинах линейного градиента по- лиакриламидного геля (5 - 10%) на приборе Хийу Калур (ЭССР). Определена оптическая плотность элюатов альбуминов, a, /, у -глобулинов. На основании полученных данных проведен расчет содержания отдельных фракций в относительных %, что отражено в табл. 4,

Из табл. 4 видно, что в сыворотках крови, полученных по предлагаемому способу, по сравнению с нативными сыворотками крови животных возрастает относительная концентрация белков с малой молекулярной массой (альбумины) и снижается концентра-ция у-глобулинов - самых тяжелых сывороточных белков, а концентрации а и ft -глобулинов в относительных % остаются практически без изменения.

Ростовые свойства сывороток крови,

полученных по предлагаемому способу, в сравнении с нативными сыворотками крови животных.

Проведены опыты по изучению ростсти- мулирующёй активности указанных сывороток крови на постоянных линиях клеток. Сыворотки брались в общепринятой 10%- ной концентрации в среде Игла MEM (рН 7,3) с глутамином и канамицином. Для работы взяты следующие культуры клеток: РК-15

- из почек взрослой свиньи, НГУК-1 - из опухоли гассерова узла крысы, Vero - из почечной ткани взрослой африканской зеленой мартышки, после 72-часового роста в матрасиках емкостью 200 мл. После смешивания суспензии с сывороткой посевная концентрация клеточной суспензии становилась 60000 клеток/мл. Посевная клеточная взвесь рассеивалась по 2 мл во флакончики емкостью 10 см с посевной

площадью 3 см2. Плотность посева - 40000 клеток/см2. Клетки выращивались в термостате при 37°С и подсчитывались через каждые 24 ч после посева. Динамики роста вышеназванных культур клеток по индексу пролиферации с разными сыворотками крови представлены в табл. 5-7.

Результаты опытов, указанных в табл. 5 -7, на перевиваемых культурах клеток РК-15, Н ГУ К-1 и Vero, показали:

а) ростстимулирующая активность на- тивных сывороток по индексу пролиферации клеток ниже, чем у сывороток по предлагаемому изобретению;

б) в опытах на культурах клеток НГУК-1 и Vero наиболее высокие индексы пролиферации отмечены в присутствии сыворотки крови кур, полученной по предлагаемому способу;

в) при данной плотности посева (40000 клеток/см ) все постоянные линии клеток образовывали монослой через 48 ч, пики количества выросших клеток отмечены через 72 ч после посева;

г) клетки, выращенные на средах Игла MEM в присутствии 10% сывороток по предлагаемому способу более жизнеспособны: падение индекса пролиферации происходит медленнее, чем в присутствии нативных сывороток крови животных.

Технико-экономическая эффективность предложенного способа устанавливается по показателям, изложенным ниже. 4 1. Ростстимулирующая активность как нативных сывороток крови животных, так и сывороток, приготовленных по предлагаемому способу, отвечает требованиям, предъявляемым к сывороткам: так при посеве перевиваемых клеток с плотностью 33 - 66 тыс. клеток/см2 сыворотка считается пригодной, если она обеспечивает образоание сплошного слоя клеток на 3 - 4 сутки от начала культивирования, не вызывая в «детках изменений дегенеративного характера, и обеспечивает индекс пролиферации не менее 4 - 6, в отличие от прототипа/где индекс пролиферации перевиваемых клеток 2,0 - 3,75. В вышеописанных опытах установлено, что при плотности посева 40 тыс. клеток/см2 индекс пролиферации в зависимости от вида сыворотки и линии клеток варьирует в следующих пределах. Нативная сыворотка крови эмбрионов коров в наших опытах обеспечивала индекс пролиферации указанных линий клеток от 6,16 до 7,48, а сыворотка крови эмбрионов коров, полученная по предлагаемому способу, - от 6,60 до 8,31. Нативная сыворотка крови кур обеспечивала индекс пролифераI

ции от 6,00 до 8,03, а сыворотка, полученная

из нее по Предлагаемому способу - от 7,76 . до 8,86. Нативная сыворотка крови бычья обеспечивала индекс пролиферации культур клеток от 5,23 до 6,71, а сыворотка бычья по предлагаемому изобретению - от 6,77 до 7,70, примерно такой же, как с нативными

сыворотками и сыворотками по предлагаемому изобретению из крови эмбрионов ко- ,

ров и кур.

2. Наряду с ростстимулирующей активностью нативных сывороток крови и сывороток, полученных по предлагаемому изобретению, были установлены и другие их

отличительные ростовые свойства:

а) при пересейе клеток в присутствии нативной сыворотки крови бычьей, практически с первых пассажей, наблюдается стертость границ между клетками; они теряют прозрачность и, наконец, изменяют форму, например клетки линии РК-15 становятся угловатыми; время сохранения монослоя 120 - 144 ч, т. е. на 24 - 48 ч меньше, чем у клеточных линий, выращива- :

емых с нативной сывороткой крови эмбрионов коров;

б) довольно ранние дегенеративные изменения, которые наступают спустя 144 - 168 ч после посева клеток в присутствии

10% нативных сывороток крови бычьей и кур в питательной среде, не отмечаются при выращивании-их на среде Игла MEM с 10% сывороток крови этих животных, приготовленных по предлагаемому способу;

в) значительные скопления клеток, которые образуются при пересевах постоянных линий клеток РК-15. НГУК-1 и Vero на среде с 10% нативной сыворотки крови бычьей не отмечаются при выращивании их на среде с

10% сыворотки крови бычьей по предлагаемому изобретению,

г) после образования монослоя клетки

переживают в средах с предлагаемыми сы воротками крови животных, будучи прикрепленными к стеклу, при комнатной температуре 1 - 1,5меси более.

Отличительные признаки и полезная эффективность предлагаемого способа получения сывороток крови животных для кульТивирования клеток сводятся к следующему:.

а) удаление из нативных сывороток крови ингибиторов роста клеток проводят простым и общедоступным способом, включающим их заморозку с последующим оттаиванием и сбор светлых слоев сыворотки, начиная сверху, до границы ее гемолизи- рованных фракций;

б) предлагаемый способ позволяет одновременно снижать в сыворотке концентрацию общего белка, в том числе у-глобу- линов, свободного гемоглобина, общих ли- пидов, в том числе общего холестерина;

в) сыворотки крови животных, приготовленные по предлагаемому способу, лучше стимулируют пролиферацию клеток по сравнению с нативными образцами;

г) в культуральной среде с сыворотками по предлагаемому изобретению культуры клеток более жизнеспособны, чём с нативными сыворотками.

Формула изобретения Способ получения сыворотки крови животных для культивирования клеток живо0

тных тканей, включающий взятие крови, отделение сыворотки, замораживание и оттаивание ее, отделение верхних светлых слоев и их стерилизацию, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, снижения концентрации ингибиторов роста культур клеток и улучшения ростовых свойств сыворотки, замораживание сыворотки проводят при (- 15) - (- 20)°С, а оттаивание - при комнатной температуре, при этом стерилизацию проводят путем фильтрации через миллипоровые .фильтры.

15

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: сыворотку крови животных замораживают при (-15) - (-20)°С, затем оттаивают при комнатной температуре. После расслоения сыворотки верхние светлые слои отделяют и стерилизуют фильтрацией через миллипоровые фильтры. Способ позволяет улучшить ростовые свойства сыворотки. 7 табл.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Т а б.л и ц а 4

Динамика роста культуры клеток РК-15

Динамика роста культуры клеток НГУК-1

Таблица 5

Таблица,б

Динамика роста культур клеток Vero

Таблица 7