БИВАЛЕНТНАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ Российский патент 2000 года по МПК A61K39/255 C12N7/00 C12N5/06 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретения относятся к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и могут быть использованы при разработке и изготовлении средств специфической профилактики болезни Марека.

Болезнь Марека (БМ) - высококонтагиозное, лимфопролиферативное, злокачественное, вирусное заболевание птиц. БМ регистрируется во всех странах мира, где развито промышленное птицеводство, в том числе и в нашей стране, вызывая большие экономические потери. Болезнь характеризуется образованием единичных (в начальной стадии) и множественных опухолей во внутренних органах, коже, мышцах, а также изменениями центральной и периферической нервной системы. Вирус болезни Марека (ВБМ) повреждает иммунокомпетентные органы (селезенку, тимус, клоакальную сумку) и обладает таким образом иммунодепрессивной активностью, что приводит к снижению общей резистентности птиц и повышению их чувствительности к другим болезням. В связи с этим БМ довольно часто протекает в ассоциации с другими заболеваниями. Важным средством предупреждения БМ и снижения потерь от заболевания является вакцинопрофилактика. Для специфической профилактики используют живые вакцины трех типов: из аттенуированных штаммов ВБМ (серотип 1), из природноослабленного непатогенного ВБМ (серотип 2) и из штаммов вируса герпеса индеек (ВГИ, серотип 3). Серотип 1 включает все онкогенные вирусы и аттенуированные варианты ВБМ, серотип 2 - все природноослабленные ВБМ, серотип 3 - антигенно родственные ВБМ вирусы герпеса индеек.

Известна вакцина против БМ, содержащая суспензию клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур (ФЭК), инфицированных штаммом CV1988 ВБМ 1 серотипа, сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС) и диметилсульфоксид (ДМСО) в качестве криопротектора [1, 2].

Известна вакцина против БМ, содержащая суспензию клеток ФЭК, инфицированных штаммом SB-1 вируса герпеса кур (ВГК) 2 серотипа, сыворотку крови КРС и ДМСО [2].

Известна вакцина против БМ, содержащая суспензию клеток ФЭК, инфицированных штаммом FC-126 ВГИ серотипа 3, сыворотку крови КРС и ДМСО (3, 4).

Известна вакцина против БМ, содержащая суспензию клеток ФЭК, инфицированных штаммом "ВНИВИП" ВГИ серотипа 3, сыворотку крови КРС и ДМСО [5, 6].

Недостатки известных вакцин состоят в том, что они не устраняют носительства вирулентного вируса. Оба вируса (ВГИ и ВБМ) могут одновременно персистировать в организме птицы. Известные вакцины не устраняют опасность поражения лимфатических органов птиц от высоковирулентных онкогенных штаммов ВБМ.

Известно, что би- и поливалентные вакцины, включающие вакцинные штаммы группы ВБМ - ВГИ серотипов 1, 2 и 3, проявляют более высокую иммуногенную активность по сравнению с моновалентными, особенно против очень вирулентных полевых штаммов, которые становятся преобладающими в зонах интенсивного птицеводства. Это обусловлено тем, что штаммы этой группы in vivo проявляют протективный синергизм, т.е. эффективность одного вакцинного компонента возрастает от очень низкой дозы другого и даже частичные дозы двух штаммов эффективнее полной дозы одного штамма. Известны сведения о синергизме между штаммами FC-126 (серотип 3) и SB-1 (серотип 2). Использование вакцины на основе указанных штаммов обеспечивает более высокую защиту против БМ по сравнению со смесями штаммов серотипов 1 и 3 или 1 и 2 [7, 8].

Известна поливалентная вакцина против БМ, содержащая смесь суспензий клеток ФЭК, инфицированных штаммом FC-126 ВГИ 3 серотипа и штаммами "42" и/или "50" ВГК 2 серотипа, сыворотку крови КРС и ДМСО в следующем соотношении, мас.%:
Смесь суспензий инфицированных клеток - 80-90
Сыворотка крови КРС - 5-10
ДМСО - Остальное [9]
Недостаток данной вакцины состоит в том, что она не обладает достаточно высокой иммуногенной активностью в хозяйствах с высоким уровнем заболеваемости БМ.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является бивалентная вакцина против БМ, содержащая смесь суспензий клеток ФЭК, инфицированных штаммом FC-126 ВГИ 3 серотипа и штаммом SB-1 ВГК 2 серотипа, сыворотку крови КРС и ДМСО в следующем соотношении, мас.%:
Смесь суспензий инфицированных клеток - 80-90
Сыворотка крови КРС - 5-10
ДMCO - 5-10
Штамм FC-126 является базовым компонентом вакцины, а штамм SB-1 усиливающим (10, 11).

Недостаток вакцины - прототипа состоит в том, что она также не обладает высокой иммуногенностью в хозяйствах с высоким уровнем заболеваемости БМ.

Известен способ изготовления поливалентной вакцины против БМ, включающий раздельное инфицирование культуры клеток ФЭК штаммом FC-126 ВГИ 3 серотипа и штаммом N 42 и/или N 50 ВГК 2 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы с последующим их объединением, добавление криопротектора и получение целевого продукта (9).

Недостаток данного способа состоит в том, что вакцина, полученная в соответствии с данным способом, не обеспечивает достаточную защиту птиц от заболевания БМ.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления бивалентной вакцины против БМ, включающий раздельное инфицирование культуры клеток ФЭК штаммом FC-126 ВГИ 3 серотипа и штаммом SB-1 ВГК 2 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы с последующим их объединением, добавление криопротектора и получение целевого продукта [10].

Недостаток способа - прототипа состоит в том, что вакцина, полученная данным способом, обладает низкой иммуногенной активностью в хозяйствах с высоким уровнем заболеваемости БМ.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка бивалентной вакцины против БМ на основе нового штамма ВГИ 3 серотипа и известного штамма SB-1 ВГК 2 серотипа, обладающей более высокой иммуногенной активностью по сравнению с вакциной- прототипом, и способа ее изготовления.

Технический результат от использования предлагаемых изобретений заключается в повышении иммуногенной активности бивалентной вакцины против БМ.

Указанный технический результат достигнут созданием группы изобретений, образующих единый изобретательский замысел. В группу включены изобретения, одно из которых предназначено для получения другого.

Указанный технический результат достигнут созданием бивалентной вирусвакцины против БМ, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:
1) бивалентная вакцина против БМ;
2) суспензия клеток, инфицированных штаммом ВГИ 3 серотипа;
3) из штаммов 3 серотипа вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ;
4) штамм "ВНИИЗЖ/N 110" взят в эффективном количестве;
5) вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ с биологической активностью не ниже 1•10⁵ ФОЕ/см³;
6) суспензия клеток, инфицированных штаммом ВГК 2 серотипа;
7) из штаммов 2 серотипа вакцина содержит штамм SB-1 ВГК;
8) штамм SB-1 ВГК взят в эффективном количестве;
9) вакцина содержит штамм SB-1 ВГК с биологической активностью не ниже 1•10⁴ ФОЕ/см³;
10) в качестве клеточного субстрата вакцина содержит культуру клеток ФЭК;
11) сыворотка крови КРС;
12) ДМСО;
13) вакцина содержит смесь суспензий инфицированных клеток ФЭК, сыворотку крови КРС и ДМСО в следующем соотношении, маc.%:
Cмесь суспензий инфицированных клеток - 60-70
Cыворотка крови КРС - 15-25
ДMCO - 5-15
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) бивалентная вакцина против БМ;
2) суспензия клеток, инфицированных штаммом ВГИ 3 серотипа;
3) из штаммов 3 серотипа вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ;
4) штамм "ВНИИЗЖ/N 110" взят в эффективном количестве;
5) суспензия клеток, инфицированных штаммом ВГК 2 серотипа;
6) штамм ВГК 2 серотипа взят в эффективном количестве;
7) сыворотка крови КРС;
8) ДМСО.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:
1) в качестве клеточного субстрата вакцина содержит культуру клеток ФЭК;
2) вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ с биологической активностью не ниже 1•10⁵ ФОЕ/см³;
3) из штаммов 2 серотипа вакцина содержит штамм SB-1 ВГК;
4) вакцина содержит штамм SB-1 ВГК с биологической активностью не ниже 1•10⁴ ФОЕ/см³;
5) вакцина содержит смесь суспензий инфицированных клеток ФЭК, сыворотку крови КРС и ДМСО в следующем соотношении, мас.%:
Смесь суспензий инфицированных клеток - 60-70
Сыворотка крови КРС - 15-25
ДМСО - 5-15
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) бивалентная вакцина против БМ;
2) суспензия клеток, инфицированных штаммом ВГИ 3 серотипа;
3) суспензия клеток, инфицированных штаммом ВГК 2 серотипа;
4) сыворотка крови КРС;
5) ДМСО.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком изобретения является то, что из штаммов 3 серотипа вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N 110-ДЕП" ВГИ, взятый в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:
1) в качестве клеточного субстрата вакцина содержит культуру клеток ФЭК;
2) вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ с биологической активностью не ниже 1•10⁵ ФОЕ/см³;
3) из штаммов 2 серотипа вакцина содержит штамм SB-1 ВГК;
4) вакцина содержит штамм SB-1 ВГК с биологической активностью не ниже 1•10⁴ ФОЕ/см³;
5) вакцина содержит смесь суспензий инфицированных клеток ФЭК, сыворотку крови КРС и ДМСО в следующем соотношении, мас.%:
Смесь суспензий инфицированных клеток - 60-70
Сыворотка крови КРС - 15-25
ДMCO - 5-15
Предлагаемая вакцина обладает более высокой иммуногенной активностью по сравнению с вакциной-прототипом.

Штамм "ВНИИЗЖ/N 110" является новым, ранее неизвестным вариантом ВГИ.

Указанный технический результат достигнут также созданием способа изготовления бивалентной вакцины против БМ, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1) способ изготовления бивалентной вирусвакцины против БМ;
2) раздельное инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа и штаммом ВГК 2 серотипа;
3) в качестве клеточного субстрата используют культуру клеток ФЭК;
4) из штаммов 3 серотипа используют штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ в эффективном количестве;
5) штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ используют с биологической активностью не ниже 1•10⁵ ФОЕ/см³;
6) из штаммов 2 серотипа используют штамм SB-1 ВГК в эффективном количестве;
7) штамм SB-1 ВГК используют с биологической активностью не ниже 1•10⁴ ФОЕ/см³;
8) инкубирование зараженной культуры;
9) сбор вируссодержащей клеточной массы;
10) объединение вируссодержащих клеточных масс;
11) добавление криопротектора;
12) смесь суспензий инфицированных клеток ФЭК, сыворотку крови КРС и ДМСО берут в соотношении 12:16-3:5- 1:3 соответственно;
13) получение целевого продукта.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) способ изготовления бивалентной вакцины против БМ;
2) раздельное инфицирование культуры клеток штаммом "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ 3 серотипа и штаммом ВГК 2 серотипа;
3) инкубирование зараженной культуры;
4) сбор вируссодержащей клеточной массы;
5) объединение вируссодержащих клеточных масс;
6) добавление криопротектора;
7) получение целевого продукта.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его вьполнения или особые условия использования:
1) в качестве клеточного субстрата используют культуру клеток ФЭК;
2) штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ используют с биологической активностью не ниже 1•10⁵ ФОЕ/см³;
3) из штаммов 2 серотипа используют штамм SB-1 ВГК в эффективном количестве;
4) штамм SB-1 ВГК используют с биологической активностью не ниже 1•10⁴ ФОЕ/см³;
5) смесь суспензий инфицированных клеток ФЭК, сыворотку крови КРС и ДМСО берут в соотношении 12:16 -3:5-1:3 соответственно.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) способ изготовления бивалентной вакцины против БМ;
2) раздельное инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа и штаммом ВГК 2 серотипа;
3) инкубирование зараженной культуры;
4) сбор вируссодержащей клеточной массы;
5) объединение вируссодержащих клеточных масс;
6) добавление криопротектора;
7) получение целевого продукта.

По сравнению со способом-прототипом существенным отличительным признаком изобретения является использование нового штамма "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ, взятого в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:
1) в качестве клеточного субстрата используют культуру клеток ФЭК;
2) штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ используют с биологической активностью не ниже 1•10⁵ ФОЕ/см³;
3) из штаммов 2 серотипа используют штамм SB-1 ВГК в эффективном количестве;
4) штамм SB-1 ВГК используют с биологической активностью не ниже 1•10⁴ ФОЕ/см³;
5) смесь суспензий инфицированных клеток ФЭК, сыворотку крови КРС и ДМСО берут в соотношении 12:16 -3:5- 1:3 соответственно.

Бивалентная вакцина, полученная предлагаемым способом, обладает более высокой иммуногенной активностью по сравнению с аналогичным препаратом, полученным способом - прототипом.

Достижение технического результата от использования предлагаемого способа объясняется тем, что при изготовлении вакцины используют новый штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ.

Исходный вирус для получения штамма "ВНИИЗЖ/N 110" выделен в 1998 году из эпителия перьевых фолликулов СПФ-цыплят, иммунизированных вируссодержащим материалом из штамма FC-126 ВГИ. Производственный штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ получен методом перемежающихся пассажей через организм СПФ-цыплят и культуру клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур. Штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ представляет собой апатогенный генетически однородный вирусный материал, легко культивируемый в культуре куриных эмбриональных фибробластов с высокой биологической активностью (титр вируса 2,0-3,0•10⁶ ФОЕ/см³) и вызывающий напряженный иммунитет по сравнению со штаммом FC-126 у привитой птицы.

Штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 18.12.98. под регистрационным номером "ВНИИЗЖ/N 110-ДЕП".

Сущность изобретения пояснена на графическом материале (чертеж), на котором представлена нуклеотидная последовательность фрагмента гена gB 966-1296 штамма "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ (жирным шрифтом отмечены его нуклеотидные отличия от штамма FC-126).

Штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки
Штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ относится к семейству Herpesviridae, роду Herpesvirus, серотипу 3. На основании сравнительного электронно-микроскопического изучения производственного штамма FC-126 ВГИ и штамма "ВНИИЗЖ/N 110" при репродукции их в культурах клеток установлена идентичность характеристик обоих штаммов. Эти вирусы проходили онтогенетический цикл развития в нуклеоплазме, а в цитоплазме - завершающие стадии морфогенеза. Внутриядерный цикл развития включает стадии виропласта, нуклеоида, сборку нуклеокапсида, формирование наружной суперкапсидной мембраны. Наиболее частой формой, присутствующей на всех стадиях культивирования, является нуклеокапсид с нуклеоидом, представленным плотным образованием, заключенным в капсидную белковую оболочку. При электронно-микроскопическом исследовании штамм "ВНИИЗЖ/N 110" представлен типичными для вирусов герпеса группами В вирионами, имеющими икосаэдрическую форму, нуклеокапсид содержит 2-нитевую ДНК. В ядре пораженной клетки вирион имеет величину 90-100 нм, в цитоплазме размер его увеличивается за счет белковой оболочки до 180-200 нм. Оболочка состоит из 162 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ относится к серотипу 3. При введении в организм вызывает латентно протекающую вирусемию. Антитела к данному вирусу обнаруживают в крови цыплят к 14-21-дневному сроку с дальнейшим нарастанием к 40-60 дню. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП и ИФА. Активность в РСК не установлена.

Концентрированный антиген "ВНИИЗЖ/N 110" реагирует в РДП со специфическими сыворотками ВГИ и ВБМ. Выявляются общие антигены с ВБМ в прямой и непрямой РИФ. При разрушении клетки вступает в реакцию с антителами к ВГИ и ВБМ в РН. В ИФА вступает в реакцию с антителами к ВГИ и ВБМ.

Биотехнологические характеристики
Штамм "ВНИИЗЖ/N 110" активно размножается в СПФ-эмбрионах кур и в первично-трипсинизированной культуре фибробластов СПФ-эмбрионов кур. Трипсинизацию эмбрионов и культивирование фибробластов проводят по общепринятым методикам с использованием смеси сред на основе ГЛА, Игла и 199, взятых в равных частях, с добавлением 10% эмбриональной сыворотки КРС. Клетки фибробластов выращивают во флаконах емкостью 50 см³ и 100 см³ (Повицкого), в матрасах емкостью 1,5 дм³ и в роллерных 3-литровых сосудах. Посевная концентрация для флаконов и матрасов составляет 400-500 кл/см³, для роллерных сосудов от 1,2 до 1,5 млн.кл/см³. При размножении в культуре фибробластов вирус проявляет ярко выраженный цитопатический эффект - образование характерных фокусов, состоящих из рефрактильных округлых клеток (поликариоцитов). Размеры фокуса достигают 0,1-0,2 мм. При проведении последовательных пассажей в культуре фибробластов СПФ-эмбрионов кур инфекционный титр вируса увеличивался и достигал 2,0-3,0•10⁶ ФОЕ/см³ (фокусообразующих единиц).

При заражении 6-суточных СПФ-эмбрионов кур в желточный мешок штамм "ВНИИЗЖ/N 110" вызывает их гибель до 20% на 3-5 сутки инкубации. У павших эмбрионов отмечают отставание в росте, гепатиты, увеличение селезенки и почек. На хориоаллантоисной оболочке образуются мелкие бляшки серовато-белого цвета звездчатой формы размером до 1 мм в небольших количествах. У эмбрионов развивается гепатит. Штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ предназначен для использования в качестве сырья для изготовления живой вакцины против БМ.

Результаты определения репродуктивной способности штамма "ВНИИЗЖ/N 110" в культуре клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур представлены в таблице 1.

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм "ВНИИЗЖ/N 110" является ДНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 108-120•10⁶ Да. Нуклеиновая кислота представлена двуцепочечной линейной молекулой. Содержание G+C- 46%. Вирион состоит из нуклеоида, икосаэдрического капсида, асимметрично расположенного вокруг капсида электронно-плотного материала, обозначаемого как тегумент, и липопротеидной оболочки. Вирионная ДНК участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Основными антигенными белками являются гликопротеины A (gA) и В (gB). Гликопротеин В играет важную роль в индукции защитного иммунитета и является высококонсервативным среди герпесвирусов. Он представляет собой комплекс трех гликопротеинов: gp 49, gp 60 и gp 100.

Проведено определение первичной структуры фрагмента гена gB вируса с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и секвенирования амплифицированного фрагмента.

Изучение нуклеотидной последовательности генома штамма "ВНИИЗЖ/N 110" методом секвенирования по Сенсеру показало, что фрагмент гена gB 966-1296Н имеет 2 нуклеотидные замены в позициях 1038Н "C" на "T", 1200H "A" на "G" и одну замену в позиции 1175H с "T" на "C" в отличие от штамма FC-126, представленного в международном ген-банке. Таким образом, штамм "ВНИИЗЖ/N 110" отличается от штамма FC-126 по трем нуклеотидным основаниям, однако все три мутации не приводят к заменам соответствующих аминокислот. Гомология нуклеотидной структуры исследованного фрагмента штаммов FC-126 и "ВНИИЗЖ/N 110" составляет 99,1%. Результаты исследований представлены на прилагаемом графическом материале.

Устойчивость к внешним фактором
Устойчивость штамма "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ к физическим и химическим факторам характеризуется следующими данными. Центрифугирование при 50000 g осаждает вирус в течение 1 час. В пределах pH 4-10 вирус чувствителен к эфиру.

Вирус выдерживает неоднократное замораживание - оттаивание и воздействие ультразвуком в течение 10 мин. Полная термоинактивация вируса происходит при 4^oC через 2 недели хранения, при 20-25^oC - через 4 дня, при 37^oC - через 18 часов и при 60^oC - за 10 мин.

Хранение и консервирование
Вирус сохраняется в клеточно-ассоциированном виде в смеси из равных объемов сред на основе гидролизата лактальбумина (ГЛА), Игла и 199 с 20% сыворотки КРС и 10% диметилсульфоксида в герметически запаянных ампулах в жидком азоте при - 196^oC в течение 24 месяцев.

Патогенные свойства
Не вызывает инфекции у птиц, контагиозность не установлена. Лабораторные и домашние животные к вирусу не чувствительны.

Иммуногенность штамма
Штамм "ВНИИЗЖ/N 110" вызывает иммунитет в дозе 1000 ФОЕ у 90-98% цыплят в производственных условиях. Иммуногенность не меняется в течение 5 последовательных пассажей.

Дополнительные признаки и свойства
Штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ свободен от контаминации бактериальной и грибковой флорой, чужеродными вирусами и микоплазмами, безвреден в 10-кратной дозе для суточных цыплят.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом ВГИ.

В таблице 2 приведены результаты сравнительного изучения признаков и свойств штамма "ВНИИЗЖ/N 110" и штамма FC-126.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемых изобретений, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемых изобретений. Определение из перечня выявленных аналогов прототипов, как наиболее близких по совокупности признаков аналогов, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины и способа ее изготовления, изложенных в независимых пунктах формулы.

Следовательно, заявляемые изобретения соответствуют условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемых решений условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительные части независимых пунктов формулы. Результаты поиска показали, что предлагаемые решения не вытекают для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемых изобретений), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемых изобретений преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вакцина и способ ее изготовления соответствуют условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемых изобретений пояснена примерами их исполнения.

Пример 1.

Бивалентную вакцину готовят следующим образом. Для получения клеточной суспензии и выращивания первичных культур клеток ФЭК и раздельного культивирования штамма "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ и штамма SB-1 ВГК используют трипсин, солевой раствор Хенкса или Эрла, среду Игла, 0,5% раствор ГЛА на растворе Хенкса (ГЛАХ) или Эрла (ГЛАЭ), среду 199 и сыворотку крови КРС. В качестве ростовой среды используют смесь из равных объемов сред на основе гидролизата лактальбумина (ГЛА), Игла и 199 с 10% сыворотки крови КРС.

pH ростовой среды должен быть в пределах 7,0-7,2.

В качестве поддерживающей среды для культивирования штамма "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ используют смесь из равных объемов сред на основе ГЛА, Игла и 199 с 2% сыворотки крови КРС.

pH поддерживающей среды должен быть в пределах 7,4-7,6.

Для получения первичной культуры клеток используют СПФ-эмбрионы кур 11-12-суточного возраста. Эмбрионы разделывают в асептических условиях и промывают 3-5 раз раствором Хенкса, содержащим по 200 Ед/см³ пенициллина и стрептомицина. После этого эмбрионы помещают в плоскодонную емкость объемом 1-2 дм³ и заливают теплым (36-37^oC) 0,25-0,3% раствором трипсина в соотношении ткани и жидкости 1:5. Емкость устанавливают на термостатирующую магнитную мешалку на 35 минут. Емкость снимают с магнитной мешалки, жидкость фильтруют в центрифужный флакон, в который добавляют 2% к объему жидкости сыворотки крови КРС для нейтрализации действия трипсина. Отфильтрованную клеточную суспензию немедленно центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования трипсин сливают, а к клеточному осадку добавляют питательную ростовую среду в объеме, равном удаленному трипсину, и энергичным встряхиванием ресуспендируют. Полученную клеточную суспензию фильтруют. Фильтр промывают ростовой средой в объеме 100-200 см³. Концентрация данной суспензии должна составлять ≈ 10 млн. кл/см³. Количество клеток подсчитывают в камере Горяева. Концентрированную суспензию клеток разводят до посевной концентрации 1,2-1,5 млн/см³ для бутылей и 0,6-0,7 млн/см³ для 50 мл флаконов, используемых для титрования вакцинного вируса, и расфасовывают по емкостям. Бутыли вращают со скоростью 8-10 об/мин. Для заражения вирусами используют 28-48 часовой монослой клеток. Для изготовления производственной серии вакцины используют вирус маточной расплодки, проверенный на стерильность, безвредность, отсутствие контаминации чужеродными вирусами и микоплазмами и имеющий активность: для штамма "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ не ниже 1•10⁵ ФОЕ/см³, для штамма SB-1 ВГК - 1•10⁴ ФОЕ/см³.

Изготовление производственной серии вакцины включает четыре этапа: "освежение" и поддержание вируса в пассажах, съем инфицированных клеток и формирование серии вакцины, замораживание клеток и контроль серии вакцины.

Освежение вируса проводят двумя последовательными пассажами. Для этого в бутылях с монослоем культуры клеток ФЭК проводят замену ростовой среды на поддерживающую и вносят в бутыль вирус из расчета: для штамма "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ 200000 ФОЕ, для штамма SB-1 ВГК 100000 ФОЕ. Количество ампул, используемых для заражения, определяют, исходя из титра маточного штамма вируса. Ампулы достают из жидкого азота и немедленно помещают в воду с температурой 27^oC до полного размораживания, затем ампулы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода, фламбируют и вскрывают. Содержимое ампул объединяют и разводят питательной средой из расчета, чтобы в каждом см³ суспензии содержалось 10000 ФОЕ. Для первого пассажа необходимо заражать не менее 6 бутылей. Бутыли с зараженным монослоем помещают в термальные комнаты на 3 суток с ВГИ и 5-7 суток с ВГК. К моменту сбора вируса типичное ЦПД в виде фокусов должно быть отчетливо видно под микроскопом (30-50% поражения монослоя). Из бутылей удаляют поддерживающую среду и вносят подогретый до 37^oC 0,25% раствор трипсина из расчета 90-120 см³ на бутыль. Монослой смачивают раствором трипсина в течение 1-3 минут, затем его быстро удаляют, а бутыли помещают в термальную комнату на 10-15 минут или вращают при комнатной температуре 5-10 минут со скоростью 20 об/мин. По истечении времени в бутыли вносят поддерживающую среду без сыворотки, энергичным встряхиванием отслаивают клетки от стекла и суспендируют в ней, не допуская их разбрызгивания по поверхности бутыли. Полученным вирусом проводят второй пассаж из расчета: для ВГИ - 1:5, для ВГК - 1: 10, т.е. инфицированными клетками, снятыми с 1 бутыли, можно заразить 5-10 бутылей. Вирус второго пассажа культивируют в течение: для ВГИ - 48-72 часа, для ВГК - 98-120 часов. При 70-80% поражения монослоя вирусом второго пассажа проводят съем инфицированных клеток. Для этого в бутыль вносят 60-90 см³ 0,3% раствора трипсина, подогретого до 37^oC, и вращают бутыли 15-20 минут в термальной комнате. Затем резким встряхиванием клетки отслаивают от стекла и собирают полученную суспензию в центрифужный флакон, в котором находится сыворотка крови КРС из расчета 2% к объему снятых клеток. Клеточную суспензию подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 минут, после этого трипсин удаляют и во флакон вносят питательную среду в небольшом объеме (10 см³ на бутыль) без сыворотки и тщательно ресуспендируют осадок клеток. Затем концентрацию клеток доводят до 10-12 млн/см³ поддерживающей средой. Концентрацию клеток определяют в камере Горяева. Объем маточной производственной расплодки должен быть не менее 500 см³. При необходимости проводят 3 и 4 пассаж.

В этом случае клеточно-связанным вирусом второго пассажа заражают монослойные культуры клеток (3 пассаж) из расчета 1:10-1:20 для штамма "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ и 1:20- 1:50 для штамма SB-1 ВГК. Четвертый пассаж выполняют из расчета 1:50 - 1:100 для штамма "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ, 1:50 для штамма SB-1 ВГК. Культуру клеток, инфицированных штаммом "ВНИИЗЖ/N 110", инкубируют в течение 48-72 часов, а культуру клеток, инфицированных штаммом SB-1 ВГК, - в течение 120 часов. Сбор инфицированных клеток проводят также, как и при съеме вируса второго пассажа. После удаления трипсина в бутыли вносят поддерживающую среду с 20% сыворотки крови КРС и 10% ДМСО. Суспензию инфицированных клеток, сыворотку крови КРС и ДМСО берут в соотношении 12:16 - 3:5 - 1:3 соответственно. Суспензии инфицированных клеток объединяют, при этом концентрация инфицированных клеток в суспензии должна быть 5-10 млн/см³ для штамма "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ и 4,0-4,5 млн/см³ для штамма SB-1 ВГК. Собранную суспензию инфицированных клеток разливают по 1-2 см³ в предварительно маркированные ампулы, закрывают стерильной ватой, помещают на кювет со льдом, запаивают в пламени газовой горелки с последующим замораживанием инфицированных клеток методом постепенного понижения температуры. Сначала ампулы помещают в холодильник (2-4^oC) на 40-60 мин, затем 40-60 мин ампулы выдерживают при -40^oC. После этого ампулы немедленно погружают в жидкий азот, помещая их в отдельный сосуд Дьюара или в отдельный контейнер ХБ.

Контроль готовой вакцины осуществляют в соответствии с ТУ 9384-014-00008064-96. Для этого готовят последовательные десятикратные разведения вируса на питательной среде без сыворотки от 10^-1 до 10^-5. Каждое разведение вируса тщательно пипетируют, не допуская образования пены в пробирке, и по 0,5 см³ вносят в 3-5 флаконов, предварительно освобожденных от ростовой среды и залитых поддерживающей средой. Зараженную культуру инкубируют при 39-40^oC со сменой поддерживающей среды через 24 часа. Через 4-5 суток после заражения клеточный монослой окрашивают амидовым черным. Результаты титрования учитывают по наличию точечных окрашенных фокусов. Подсчитывают фокусы в 3-5 флаконах, соответствующих одному и тому же разведению вируса, в котором число фокусов не превышает 100 и не менее 10.

Титр вируса вычисляют по формуле

где Т - титр вируса в ФОЕ/см³,
А - среднее количество фокусов во флаконе,
P - разведение вируса,
2 - коэффициент пересчета на 1 см³.

Титр базового компонента вакцины (штамм "ВНИИЗЖ/N 110") должен быть не ниже 1•10⁵ ФОЕ/см³, а усиливающего компонента (штамм SB-1) не ниже 1•10⁴ ФОЕ/см³. По титру устанавливают количество иммунизирующих доз в 1 см³. За одну прививную дозу принимают 1000±100 ФОЕ для штамма "ВНИИЗЖ/N 110" и 300±100 ФОЕ для штамма SB-1.

Полученная вакцина представляет собой замороженную суспензию желто-розового цвета, при разбавлении представляет собой гомогенную взвесь.

Срок годности бивалентной вакцины при условии хранения ее в жидком азоте 12 месяцев.

Бивалентная вирусвакцина жидкая культуральная применяется с профилактической целью. Вакцинируют цыплят в первые часы после выборки из выводных шкафов непосредственно в инкубатории.

Перед проведением прививок пенал с бивалентной вирусвакциной осторожно вынимают из сосуда Дьюара. Затем из пенала извлекают необходимое количество ампул и быстро переносят в емкости с водой при 35-37^oC.

После размораживания ампулы вскрывают и вакцину переносят шприцем во флаконы с разбавителем, содержащим полиэтиленгликоль, соблюдая асептику. Разбавитель при смешивании должен быть охлажден до температуры холодильника 4-8^oC.

В каждом флаконе, содержащем 160 см³ разбавителя, разводят 800 доз. Разведенную вакцину вводят цыплятам внутримышечно в верхнюю треть бедра при помощи инъектора полуавтоматического ИП-1 или ИП-2, или шприцем объемом 1 см³. Шприцы и иглы перед использованием стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 10-15 мин.

Полученная бивалентная вакцина против БМ имеет оптимальный компонентный состав, мас.%:
Суспензия клеток, инфицированных штаммом ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ - 40-50
Суспензия клеток, инфицированных штаммом "ВНИИЗЖ/N 110" ВГК - 20-30
Сыворотка крови КРС - 15-25
ДМСО - 5-15
Пример 2.

Проведены испытания бивалентной вакцины против БМ, содержащей, мас.%:
Суспензия клеток, инфицированных штаммом "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ - 46,7
Суспензия клеток, инфицированных штаммом SB-1 ВГК - 23,3
Сыворотка крови КРС - 20,0
ДМСО - 10,0
Для определения иммуногенной активности бивалентной вакцины использовали односуточных СПФ-цыплят. Для этого были сформированы 5 групп цыплят по 20 голов каждая:
1 группу цыплят вакцинировали моновалентной вакциной из штамма "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ (иммунизирующая доза 1000 ФОЕ/0,2 см³);
2 группу цыплят вакцинировали моновалентной вакциной из штамма SB-1 ВГК (иммунизирующая доза 300 ФОЕ/0,2 см³);
3 группу вакцинировали бивалентной вакциной из штамма "ВНИИЗЖ/N 110" в сочетании со штаммом SB-1 в иммунизирующих дозах 1000 ФОЕ/0,2 см³ + 300 ФОЕ/0,2 см³ соответственно;
4 группу вакцинировали бивалентной вакциной из штамма "ВНИИЗЖ/N 110" в сочетании со штаммом SB-1 в иммунизирующих дозах 1000 ФОЕ/0,2 см³ + 100 ФОЕ/0,2 см³ соответственно;
5 группа была контрольной.

Односуточным цыплятам вакцины вводили в объеме 0,2 см³ внутримышечно в области бедра. Контрольное заражение проводили через 7 дней после вакцинации вирулентным штаммом "Jm" ВБМ в объеме 0,2 см³ внутримышечно. Продолжительность опыта зависела от падежа 50% голов контрольной группы, что составило 65 дней. На протяжении всего опыта за птицей вели клиническое наблюдение. Весь падеж вскрывали и учитывали патологические изменения внутренних органов. Эффективность вакцинации определяли после убоя опытной птицы с учетом изменений как при вскрытии, так и данных вскрытия павшей в процессе опыта птицы.

Эффективность рассчитывали по формуле

где Э - эффективность вакцинации;
В - % птицы с признаками БМ в вакцинированной группе;
К - % птицы с признаками БМ в контрольной группе.

Результаты исследований представлены в таблице 3.

Пример 3.

Сравнительная оценка эффективности вакцин против БМ
В опытах использованы жидкая вирусвакцина против БМ на основе штамма FC-126 ВГИ (фирма "Марикол", Хорватия), жидкая вирусвакцина против БМ на основе штамма CVJ-988 ВБМ (фирма "Интервет", Голландия), жидкая поливалентная вирусвакцина против БМ на основе штамма FC-126 ВГИ и штаммов "42" и/или "50" ВГК (фирма "БИОК", Россия), сухая вирусвакцина против БМ на основе штамма FC-126 ВГИ (фирма "Плива", Болгария), сухая вирусвакцина против БМ на основе штамма FC-126 ВГИ (Щелковский биокомбинат, Россия), сухая вирусвакцина против БМ на основе штамма FC-126 ВГИ (ВНИиТИБП, Россия) и бивалентная вирусвакцина против БМ на основе штамма "ВНИИЗЖ/N 110" ВГИ и штамма SB-1 ВГК (ВНИИЗЖ, Россия). Исследования проведены в условиях Ковровской птицефабрики Владимирской области, Ногинской птицефабрики Московской области и Александровского племптицерепродуктора Владимирской области. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании группы предлагаемых изобретений следующей совокупности условий:
- бивалентная вакцина против БМ и способ ее изготовления, воплощающие предлагаемые изобретения, предназначены для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для группы предлагаемых изобретений в том виде, как они охарактеризованы в независимых пунктах формулы изобретения, подтверждена возможность их осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- при использовании предлагаемых бивалентной вакцины против БМ и способа ее изготовления достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения.

Следовательно, предлагаемая группа изобретений соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания
1. Справочник. Борисович Ю.Ф., Кириллов Л.В. Ветеринарные препараты. / Под ред. Осидзе Д.Ф. - М.: Колос, 1981, с. 140- 144.

2. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998, с. 710-712.

3. Временная инструкция по изготовлению и контролю клеточной культуральной вирусвакцины против БМ из штамма FC-126 ВГИ. Утверждена ГУВ МСХ СССР 04.06.84.

4. Сюрин В. Н. и др. Вирусные болезни животных. - М: ВНИТИБП, 1998, с. 710-719.

5. Патент России N 2059404, А 61 К 39/255, 10.05.96.

6. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998, с. 712 и 713.

7. Witter R.L. et al. Avian Pathol, 1984, 13, 1:75.

8. Witter R.L. World's Poultry, 1989, 45, 1:60.

9. Пат. России N 2059414; A 61 К 39/255, 10.05.96.

10. EP N 0496135, A 61 К 39/255, 1992.

11. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998, с. 713-715.

Изобретение предназначено для профилактики болезни Марека (БМ). Бивалентная вакцина содержит в качестве базового компонента штамм "ВНИИЗЖ/ 110 - ДЕП" (коллекция ВГНКИ) вируса герпеса индеек (ВГИ). И в качестве усиливающего компонента - штамм SB-1 ВГК. Вакцина содержит смесь суспензий инфицированных клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур (ФЭК), сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС) и диметилсульфоксид (ДМСО). Смесь суспензий инфицированных клеток берут в количестве 60-80 мас.%, сыворотку крови КРС - 15-25 мас. %, ДМСО - остальное. Штамм ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110" ВГИ используют с биологической активностью не ниже 1•10⁵ ФОЕ/см³, а штамм SВ-1 ВГК - не ниже 1•10⁴ ФОЕ/см³. Культуру клеток ФЭК инфицируют каждым вирусом раздельно. Готовую вакцину замораживают и хранят в жидком азоте. Изобретение повышает иммуногенную активность вакцины. 2 с. и 10 з.п. ф-лы, 1 л., 4 табл.

1. Бивалентная вакцина против болезни Марека, содержащая смесь суспензий клеток, инфицированных штаммом вируса герпеса индеек 3 серотипа и штаммом вируса герпеса кур 2 серотипа, сыворотку крови крупного рогатого скота и диметилсульфоксид, отличающаяся тем, что из штаммов 3 серотипа вакцина содержит штамм вируса герпеса индеек, сем. Herpesviridae, род Herpesvirus, ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" в эффективном количестве. 2. Бивалентная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве инфицированных клеток вакцина содержит культуру клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур. 3. Бивалентная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что вакцина содержит штамм ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" вируса герпеса индеек с биологической активностью не ниже 1 • 10⁵ ФОЕ/см³. 4. Бивалентная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из штаммов 2 серотипа вакцина содержит штамм SB-1 вируса герпеса кур в эффективном количестве. 5. Бивалентная вакцина по п.4, отличающаяся тем, что вакцина содержит штамм SB-1 вируса герпеса кур с биологической активностью не ниже 1 • 10⁴ ФОЕ/см³. 6. Бивалентная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что вакцина содержит смесь суспензий фибробластов СПФ-эмбрионов кур, инфицированных штаммом ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" вируса герпеса индеек и штаммом SB-1 вируса герпеса кур, сыворотку крови крупного рогатого скота и диметилсульфоксид в следующем соотношении, мас.%:
Смесь суспензий клеток инфицированных штаммом ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" - 60 - 80
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 15 - 25
Диметилсульфоксид - 5 - 15
7. Способ изготовления бивалентной вакцины против болезни Марека, включающий раздельное инфицирование клеток штаммом вируса герпеса индеек 3 серотипа и штаммом вируса герпеса кур 2 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей суспензии клеток с последующим их объединением, добавлением криопротектора и получением целевого продукта, отличающийся тем, что из штаммов 3 серотипа используют штамм вируса герпеса индеек, сем. Herpesviridae, род Herpesvirus, ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" в эффективном количестве. 8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что инфицируют культуру клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур. 9. Способ по п.7, отличающийся тем, что получают целевой продукт с содержанием штамма ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" вируса герпеса индеек с биологической активностью не ниже 1 • 10⁵ ФОЕ/см³. 10. Способ по п.7, отличающийся тем, что из штаммов 2 серотипа используют штамм SB-1 вируса герпеса кур в эффективном количестве. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что получают целевой продукт с содержанием штамма SB-1 вируса герпеса кур с биологической активностью не ниже 1 • 10⁴ ФОЕ/см³. 12. Способ по п.7, отличающийся тем, что в смесь суспензий клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур, инфицированных штаммом ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" вируса герпеса индеек и штаммом SB-1 вируса герпеса кур добавляют сыворотку крови крупного рогатого скота и диметилсульфоксид в соотношении 12:16 - 3:5 - 1:3 соответственно.