. Изобретение относится к вирусологии и иммунологии, точнее к способам определения антител к вирусу иммунодефицита чело- века с помощью твердофазного иммуноферментного метода анализа с использованием синтетического пептида в качестве антигена и синтеза реагентов для этого.
Целью изобретения является повышение чувствительности способа определения антител и ВИЧ без уменьшения специфичности.
Пример 1. Синтез пептида формулы биотин-GlyGlyTrpGlyCysSecGlyLysLeulleCys ThrThrAlaValProTrpAsn- ОН (1) осуществляют твердофазным методом пептидного синтеза на синтезаторе Beckmam-990. США ступенчатым наращиванием пептидной цепи. В качестве носителя используют сополимер
полистирола с 1% дивинилбензола производства BiO-Rad Laboratories. США.
Для защиты боковых функциональных групп используют следующие г|эуппировки: бензильную (Вг1) - для гидроксильных групп серина и треонина. 4-метилбензильную (MeBzl) - для сульфгидрильной группы цис- теина, 2-хлорбензилоксикарбонильную (CIZ) -для е-аминогруппы лизина. В качестве временной защиты а-аминогрупп аминокислот- используют трет-бутилоксикарбонильную (Вое) группу.
Аминометилполимеру (1,8 г. 1 ммоль) дают набухнуть в 30 мл в течение 30 мин. затем присоединяют Boc-Asn- ОСН2СбН4СН2СООН (1,1 г, 2,9 моль) с помощью ,Ы-дициклогексилкарбодиимида СДЦГК) (0.7 г, 2.9 ммоль) в 20 мл СНС1з в течение2 ч. После промывки СНС1зЗх20 мл, аминоацилполимер обрабатывают 20 мл
ю ю
ON 1
смеси диизопропилэтиламин (ДИПЭА): уксусный ангидрид 2:1 в течение 30 мин для блокирования непрореагировавших аминогрупп полимера. Количество аминогрупп согласно нингидриновому тесту 0,95 ммоль (95%).
Все аминокислоты присоединяют по следующей общей методике в виде оксибен- зотриазоловых эфиров: 2 ммоль аминокислоты и 2 ммоль оксибензотриазола растворяют в 10 мл СНС1з, охлаждают до 0°С и добавляют раствор 2 ммоль ДЦГК в 10 мл СНС1з, после перемешивания втечение . 10 мин при к смеси добавляют 10 мл ДМФА и приливают ее к пептидилполиме- ру, перемешивают 1 ч при 30°С; затем промывают пептидилполимер ДМФА 3x20 мл, СНС1зЗх20мл.
Молекулу биотина присоединяют по следующей методике: пептидилполимер промывают диметилсульфоксидом (ДМСО) ЗХ 20 мл, 3 ммоль биотина и 3 ммоль оксибензотриазола растворяют в 10 мл ДМСО и добавляют 3 ммоль ДЦГК, после перемешивания при комнатной температуре в течение 10 мин смесь добавляют к пептидилполимеру, перемешивают 1,5 ч при 30°С и промывают ДМСО 3x20 мл, CHCfa Зх 20 мл.
Для удаления временной защитной группы Вое используют смесь трифторук- сусная кислота СГФУ):СНС1з 1:1, содержащую 0,2% индола для предотвращения побочных реакций по триптофановому остатку.
Стандартная методика удале1 ия Вое группы: промывка СНС1зЗх20 мл 5 мин, обработка смесью ТФУ:СНС|з (0,2% индола) 1:1 1x30 мл 20 мин, промывка СНС1зЗх20 мл 5 мин, нейтрализация 7%-ным раствором в ДМФА 1x30 мл 10 мин, промывка ДМФА 3x20 мл 5 мин.
После сборки пептида получают 4,8 г пептидилполимера формулы биотин- GiyGlyTrpGlyCys(MeBre}-Ser(Bre)Gly-Lys(Clz) -Leu - lle-Cys(MeBrehThr(Bzl)-Thr(Bzl)Ala-Val- Рго-Тгр-А8п-ОСН2СбН4СН2СО-полимер.
Деблокирование пептида с полимера с одновременным снятием всех защитных групп осуществляют следующим образом, 1,2 г пептидилполимера помещают в реакционный сосуд прибора для работы с фторо- водородом Sakaklbara, Япония, добавляют 0,5 г п-крезола и 0,5 г п-тиокре- зола, после охлаждения сосуда жидким азотом и вакуумирования с помощью водоструйного насоса в сосуд перегоняют 10 мл безводного жидкого HF, Затем доводят температуру до 0°С и перемешивают пептидилполимер при этой температуре в
течение 1 ч, отсасывают HF на водоструй- ном насосе в течение 20 мин, промывают полимер на фильтре диэтиловым эфиром, содержащим 1 % меркаптоэтанола, для 5 предотвращения окисления цистеинов. Пептид экстрагируют 20%-ной уксусной кислотой, содержащей 1 % меркаптоэтанола. После лиофилизации получают 328 мг неочищенного продукта.
0 Для восстановления сульфгидрильных групп цистеинов 60 мг пептида после деблокирования суспендируют в 2 мл смеси ДМФА:Н20 (рН 9) 1:1 и добавляют 60 мг дитиотреитола, продувают аргоном и переме- 5 шивают при комнатной температуре сутки.
Для выделения и очистки синтезированного пептида используют препаративную высокоэффективную жидкостную хроматографию на обращенной фазе на хроматогра- 0 фе Gllson, Франция.
Для этого к суспензии пептида после восстановления добавляют 2 млТФУдля растворения осадка и раствор наносят на колонку Uitrasphere Octyl 10x250 мм (Ди Pont, 5 США) и элюируют в системе 0,5% ТФУ в воде - СНзОН при скорости 4 мл/мин и изменении градиента СНзОН от 20 до 50% за 3 мин и от 50 до 70% за 15 мин. Собирают пик, выходящий на 17 мин при детекции на 280 нм. После лио- 0 филизации получают 7,6 мг чистого пептида.
Чистоту и индивидуальность пептида подтверждают аминокислотным анализом (табл,1), масс-спектрометрически (табл. № 2) и аналитической ВЭЖХ в условиях выделения пеп- 5 тида на колонке Ultra-Sphere Octyl 4,6x250 мм (ДиРот, США), время выхода 17,2 мин. При этом, кроме предлагаемого пептида (1), используют другие синтетические пептиды из последовательности белка др41 вируса ВИЧ-1 формул 0608
HaN-TrpGlyCysSerGlyLysLeulleCysThr
623 ThrAiaValProTrpAsn-OH(II)
607 5 H2N-neTrpGlyCysSerGlyLysLeuneCysThr
625 ThrAlaValProTrpAsnAlaSer-OH(III)
605
H2N-LeuGlylleTrpGlyCysSerGlyLysLeu le 0 616
Cys-OH(IV)
591. H2N-ArglleLeuAIaValGluArgTyrLeuLysAsp
611
5 GtuGlnLeuLeuGlylleTrpGlyCysSer-OH (V) Пример 2. Анализ способности пептидов формул (I) - (V) селективно связывать антитела против вируса иммунодефицита человека I типа методом твердофазного им- муноферментного анализа.
Для анализа используют 105 сывороток, содержащих антитела к ВИЧ-1. от больных СПИД, СПИД-ассоциированным комплекс сом и бессимг томных вирусоносителей, 48 сывороток, не содержащих антител к ВИЧ- 1, но дающих положительную реакцию в иммуноферментной тест-системе Антиген, СССР, 100 сывороток от здоровых доноров крови. Наличие антител в сыворотках крови подтверждается в нескольких коммерческих тест-системах.
Опыт проводят по следующей схеме. Для пептидов II, III, IV, V пептид собирают на планшет для ИфА (типа Со Star, США) из раствора 0,1 М фосфатного буфера рН 8,0 в концентрации 2 мкг/мл в течение ночи при +4 С. После этого лунки промывают четыре раза 0,01 М фосфатным буфером рН 7,2, содержащим 0,9% хлористого натрия и 0,05% Твин-20 (ФСБ-Т). Для пептида I на планшет для ИФА (типа Со star, США) сорбируют стрептавидин из 0,1 М фосфатного буфера рН 8,0 в концентрации 2 мкг/мл в течение ночи при +4°С. После зтого лунки промывают четыре раза 0,01 М фосфатным буфером рН 7,2, содержащим 0,9% хлористого натрия и 0,05% Твин-20 (ФСБ-Т). Для рпептида 1 на планшет для ИФА (типа Со star, США) сорбируют стрептавидин из 0,1 М фосфатного буфера рН 8,0 в концентрации 2 мкг/MJfi в течение ночи при . После этого лунки промывают четыре раза ФСБ-Т. Затем в лунки планшета вносят пептид I в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2, содержащем 4% хлористого натрия, 2% бычьего сывороточного альбумина. 0,1% Твин-20 (ФСБ-Т-А) в концентрации 0.2 мкг/мл и инкубируют 30 мин при 37°С. После этого лунки промывают четыре раза.
Далее в лунки подготовленных планшетов вносят образцы сывороток крови, разведенных 1:100 в ФСБ-Т-А. в объеме 100 мкл и инкубируют 30 мин при 37 С. Затем лунки четырехкратно промывают ФСБ-Т. В отмытые лунки вносят по 100 мкл коньюгата протеина А золотИ Стого стафилококка с пероксидазой хрена в ФСБ-T-F в рабочем разведении. Планшет инкубируют 30 мин при 37оС. Затем лунки промывают четьфе раза ФСБ-Т. В лукки планшета вносят по 100 мкл субстрата: 0.04%-ный растворорто- фенилендиамина в 0,1 М цитратном буфере рН 5,0, содержащем 0,05% Н202 и инкубируют 15 мин при комнатной температуре в темном месте. Ферментативную реакцию останавливают добавление 2 н. раствора серной кислоты.
Величину оптической плотности измеряют при 492 нм на спектрофотометре Р
700 фирмы Dynatec, ФРГ. Величину контрольного уровня определяют путем прибавления 0,250 к среднему значению оптической плотности контрольной сыво- 5 ротки, не содержащей антител к ВИЧ-1,
Результаты опыта(табл. 3 и 4) показывают, что предлагаемый пептид I выявляет все 105 ВИЧ-1-положительных сывороток (чувствительность 100%) и не выявляет ни одной 10 ложноположительной сыворотки и сыворотки здоровых доноров, что говорит о высокой специфичности пептида I.
Среднее значение ОП492 здоровых доноров для пептидов I-V соответственно: 15 0,048; 0,050; 0,049; 0,047; 0,051; величина контрольного уровня: 0,298; 0,300; 0,299; 0,297; 0,301; процент узнавания (чувствительность): 105/105- 100%;74/105-70,5%; 74/105-70,5;57/105-54,3%,46/105-43,8%. 20 В таблице 3 приведены средние значения оптической плотности (ОП492) по трем повторным опытам.
Результаты определения специфично сти пептида I приведены в табл.4. 25 Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет повысить чувствительность способа определения антител к ВИЧ,в10 раз уменьшить количество пептидного антигена в опыте определения антител к ВИЧ мето- 30 дом ТФИФА. Предлагаемый способ позволяет определять антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 при использовании соответствующих пептидных антигенов.
Предлагаемый способ и пептид I можно 35 использовать в исследованиях развития гуморального ответа на внедрение вируса ВИЧ и в целях серодиагностики СПИД Формула изобретения 1. Способ твердофазного иммунофер- 0 ментного определения антител к вирусу им- мунодефицита человека, включающий взаимодействие антигена, представляющего собой синтетический пептид, с антитела- м,и тестируемой сыворотки крови и 5 последующую регистрацию результатов указанного взаимодействия, о т л и ч а ю- щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве пептидов используют меченный биотином син- 0 тетическийпептидформулы
GlyGlyTrpGlyCysSerGlyZysZeuTleCysThrThr AlaValProTrpAsn-OH, который наносят на. белок авидин или стрептавидин.
2. Меченный биотином синтетиче- 5 ский пептид формулы биотин- GlyGlyTrpGlyCysSerGlyLysLeupeCysThrThrAla /alProTrpAsn-OH для определения антител к вирусу иммунодефицита человека.
Та б,л и ца2
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТА С | 1994 |
|
RU2071349C1 |
| ИММУНОГЕННАЯ БИБЛИОТЕКА ХИМЕРНЫХ ПЕПТИДОВ, МИМИКРИРУЮЩАЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЕ МНОГООБРАЗИЕ ГИПЕРВАРИАБЕЛЬНОГО РАЙОНА V3 БЕЛКА ОБОЛОЧКИ GP120 ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА | 2002 |
|
RU2237065C2 |
| СИНТЕТИЧЕСКИЙ АНТИГЕН, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬ АУТОАНТИТЕЛА К β-АДРЕНОРЕЦЕПТОРУ | 2007 |
|
RU2356576C1 |
| ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К HBs-АНТИГЕНУ И БЛОКАТОР В ТЕСТ-СИСТЕМЕ | 2001 |
|
RU2206095C1 |
| СИНТЕТИЧЕСКИЙ АНТИГЕН, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬ АУТОАНТИТЕЛА К МУСКАРИНОВОМУ М2-РЕЦЕПТОРУ | 2012 |
|
RU2502743C1 |
| ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ, КОПИРУЮЩИХ АКТУАЛЬНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ gp120 ВИЧ1 | 2014 |
|
RU2577132C1 |
| ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЯДЕРНОМУ БЕЛКУ ВИРУСА ГЕПАТИТА С КЛАССА IGM | 1997 |
|
RU2142134C1 |
| ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА С | 1994 |
|
RU2071350C1 |
| Способ определения антител в твердофазном иммуноферментном анализе | 1989 |
|
SU1645898A1 |
| СПОСОБ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ | 2011 |
|
RU2478970C1 |
Изобретение относится к вирусологии и иммунологии, а точнее к способам определения антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) с помощью твердофазного иммуноферментного метода анализа с использованием синтетического пептида в качестве антигена и синтеза реагентов для этого. Целью изобретения является повышение чувствительности способа определения антител к ВИЧ без уменьшения специфичности. Для этого используют в качестве антигена новый синтезированный пептид формулы биотин - GLY GLY TRP GLY CYS SER GLY LYS LEN ILE CYS THR THR ALA VAL PRO TRP-ASN-он, который наносят на предварительно сорбированный белок авидин или стрептавидин. 2 с.п. ф-лы, 4 табл.
Таблица 3
Продолжение табл.З
Продолжение табл. 3
