ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА С Российский патент 1997 года по МПК A61K38/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике гепатита С.

В настоящее время для диагностики гепатита С используют иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий обнаружить в сыворотке или плазме крови пациентов антитела к белкам вируса. Основным действующим началом в этих тест-системах являются полипептиды. В частности, используется полипептид С-100-3, состоящий из 363 аминокислотных остатков, который разработан фирмами "Ortho" и "Abbott" (1).

К недостаткам полипептида С-100-3 относятся трудность его получения, а также низкая специфичность, позволяющая диагностировать заболевание только в 50% случаев (2), что обусловлено существованием нескольких генотипов вируса гепатита С, отличающихся по структуре своих геномов на 60-70%
Наиболее близким к заявляемому являются полипептиды, разработанные фирмой "Сhiron" (3). Пептиды состоят из 70-90 аминокислот и позволяют повысить специфичность анализа до 60-70%
Недостатком указанных полипептидов является трудность синтеза и низкая специфичность диагностикума на их основе, связанная с тем, что структура пептидов отвечает последовательности только некоторых, хотя и наиболее распространенных генотипов вируса, вызывающих гепатит С. Кроме того, получение полипептидов длиною 70-90 аминокислотных остатков связано с большими технологическими трудностями, низким выходом, значительной вариабельностью их физико-химических и биологических свойств и высокой себестоимостью.

Задачей, стоящей перед авторами, являлось создание более эффективной пептидной композиции, обладающей более высокой селективностью.

Было найдено, что данная задача достигается применением смесей пептидов:
X(I) H-Thr-Asn-Pro-Lys-Pro-Glu-Arg-Lys-Thr-Arg-Atg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg- Pro-Gln-Asp-Val-OH,
X(II) H-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala-Ser-Arg-Arg- Pro-Glu=Gly-Arg-OH,
X(III) H-Tyr-Ser-Ser-Met-Pro-Pro-Leu-Glu-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Pro-Asp-Leu- Ser-Asp-Gly-Ser-OH.

Лучшие результаты достигаются при применении композиции указанных трех пептидов в весовом соотношении I:II:III 2,5-3,5:0,8-1,2:8-10. Такое соотношение полипептидов, как установили авторы, определяется статистическим анализом соотношения отдельных генотипов вирусов и близко к соотношение I:II:III 3:1:9 и определяется особенностями, связанными с группами риска обследуемых.

Указанная композиция является дальнейшим усовершенствованием предыдущей разработки авторов (заявка изобретения "Пептиды, взаимодействующие с антителами к вирусу гепатита С", N 93044257 от 8.09.93 г.), позволяющим создать более универсальные пространственные структуры, способные взаимодействовать с антителами к различным генотипам вируса гепатита С. Предложенная композиция обеспечивает практически 100% выявляемость антител к различным генотипам вируса гепатита С.

Пептиды X(I)-(III) получают общепринятыми методами стандартного твердофазного синтеза на основе последовательного наращивания пептидной цепи на сополимере стирола с 1% дивинилбензолом (4). Для защиты боковых радикалов трифункциональных аминокислот использовали следующие группы: для лизина - 2-хлорбензилксикарбонильную, для гистидина тозильную, для серина, треонина, аспаргиновой и глютаминовой кислот соответствующие бензиловые эфиры, для аргинина мезитиленсульфонильную, для тирозина 2,6-дихлорбензильную.

Анализы на эффективность пептидной композиции проводили на примере 50 сывороток здоровых доноров и больных гепатитом С с помощью непрямого варианта иммуноферментного анализа. Результаты испытаний показали, что процент выявления положительных проб с использованием указанной композиции пептидов составляет 100%
Пример 1. Синтез пептида Х(I).

Для синтеза пептида Х(I) в реакционный сосуд загружают 5 г трет-бутилоксикарбонил-валинполимера. Содержание валина составляет 0,50 ммоль/г. Пептидную цепь далее наращивают по следующей программе (на присоединение одной аминокислоты) (см. табл. 1).

Если нингидриновый тест положителен, то конденсацию повторяют, начиная с п. 5. В случае отрицательного теста присоединение следующего аминокислотного остатка производят, начиная с п. 1 указанной программы.

После завершения синтеза пептидил-полимер высушивают в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы. 1 г пептидил-полимера переносят в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 1 мл тиоаниазола и 1 мл мета-крезола, охлаждают до температуры минус 78^oC и в течение 10 мин перегоняют 10 мл безводного фтористого водорода. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25% уксусной кислотой, разбавляют водой. После обессоливания на колонке с Sephadex G-10 (элюент 50% уксусная кислота) продукт очищают на колонке Altech Rsil C18 в 0,1% трифторуксусной кислоте в градиенте 10-40% ацетонитрила. Фракции, содержащие пептид, собирают и лиофилизируют. Выход с 1 г пептидил-полимера составляет 324 г (79%).

Однородность пептида определяют по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке Delta PAC C18, (0,4х15,0) см со скоростью потока 1 мл/мин при элюции 0,1% трифторуксусной кислотой в градиенте 10-40% ацетонитрила. Время удерживания 6,44 мин.

Пример 2. Синтез пептида Х(II).

Синтез, деблокирование, очистку и характеристику пептида Х(II) осуществляют теми же способами, что и пептида Х(I), за исключением того, что в реакционный сосуд загружают 5 г трет-бутилоксикарбонил-тозил-аргининполимера. Выход пептида после деблокирования 1 г пептидполимера составляет 384 г (84% ). Время удерживания в ВЭЖХ 7 мин.

Пример 3. Синтез пептида Х(III).

Синтез, деблокирование, очистку и характеристику пептида Х(III) осуществляют теми же способами, что и пептида Х(I), за исключением того, что в реакционный сосуд загружают 5 г трет-бутилоксикарбонил-тозил-серилполимера. Выход пептида после деблокирования 1 г пептидполимера составляет 315 г (76% ). Время удерживания в ВЭЖХ 6,8 мин.

Пример 4. Иммуноферментный анализ сывороток с использованием отдельных пептидов и композиции из 3 пептидов Х(I-III).

Синтезированные пептиды были использованы в твердофазном иммуноферментном анализе при исследовании сывороток от 50 больных гепатитом С и 50 здоровых доноров с целью обнаружения специфических антител. Предварительно сыворотки были проанализированы с помощью коммерческой скриннинговой ИФА тест-системой 2-ой генерации фирмы "Abbott" (Abbott HCV EIA 2,0, США).

Методика проведения ИФА включала следующие этапы:
1. Получение иммуносорбента.

Пептиды растворяют в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе, рН 9,5 до следующих конечных концентраций: X(I) 13,5 мкг/мл; Х(II) 4,5 мкг/мл; Х(III) 40,5 мкг/мл и готовят следующие растворы пептидов (см. табл. 2).

Растворы вносят по 0,1 мл в лунки планшетов и инкубируют при (4-6)^oC в течение 24 ч. Затем лунки промывают 1 раз раствором ФСБТ.

2. Связывание антител с иммуносорбентом (получение комплекса /-Аг-Ат).

Сыворотки крови, разведенные предварительно в 20 раз на ФСБТ, вносят в лунки планшета по 0,1 мл и инкубируют при 37^oC в течение 20 мин. Затем лунки промывают 3 раза раствором ФСБТ.

3. Связывание универсального конъюгата (белок А пероксидаза) с комплексом на твердой фазе (образование комплекса (-Аг-Ан-Конъюгат).

В лунки планшета вносят по 0,1 мл раствора конъюгата (коммерческий препарат, производства предприятия бакпрепаратов НИИЭМ им. Пастера) в разведении 1: 20 на ФСБТ. Планшет инкубируют при 37^oC в течение 20 мин, затем промывают 5 раз раствором ФСБТ.

4. Выявление комплекса (Аг-Ат-Конъюгат).

В лунки планшета вносят по 0,1 мл раствора субстратной смеси, состоящей из 0,05% орто-фенилендиамина, 0,005% перекиси водорода в 0,05 М фосфатно-цитратном буферном растворе, рН 5,0. Планшет инкубируют 15 мин при температуре (15-25)^oC.

5. Остановка реакции и учет результатов.

В лунки планшета добавляют по 0,05 мл 2 М раствора серной кислоты. Учет результатов осуществляют с помощью вертикального фотометра "Minireader-11" при длине волны 490 нм.

В качестве обязательного контроля для исключения неспецифических результатов при постановке реакции с каждым составом пептидов используют контроль субстратной смеси (пептиды + субстрат), контроль конъюгата (пептиды + конъюгат + субстрат), контроль сыворотки, не содержащей антител к вирусу гепатита С (НК) по данным тестирования в скриннинговых зарубежных тест-системах 2-ой генерации (Liatek HCV, Оrganon Teknika, Нидерланды).

Исследуемую пробу считают реагирующей с пептидами специфично, если оптическая плотность (ОП) раствора в лунках с исследуемой сывороткой превышала контрольный уровень (КУ), рассчитываемый по формуле:
КУ 0,1 + ОП(НК),
где ОП(НК) оптическая плотность для НК.

При ОП исследуемой пробы больше КУ пробу считают содержащей антитела к вирусу гепатита С.

Результаты эксперимента представлены в табл. 3.

Результаты проведенных испытаний показали, что заявляемая композиция обеспечивает более высокую эффективность по сравнению с ее отдельными компонентами.

Предлагаемая смесь пептидов обеспечивает практически 100% диагностику заболевания гепатитом С.

Выпуск нового диагностикума осуществляется в ТОО "Аквапаст".

Изобретение относится к медицине для диагностики вирусного гепатита С. Сущность изобретения: для диагностики используют пептидную композицию, способную связываться с антителами к вирусу гепатита С. Указанную способность проверяли в непрямом варианте иммуноферментного анализа с сыворотками больных гепатитом С и здоровых доноров. Использование композиции обеспечивает 100% выявляемость при 100% специфичности. 3 табл.

1. Пептидная композиция для определения антител к вирусу гепатита С, включающая пептиды, взаимодействующие с антителами к вирусу гепатита С, отличающаяся тем, что она включает в себя пептиды
Х(1) H-Thr-Asn-Pro-Lys-Pro-Glu- Arg-Lys-Thr-Arg-Arg-Asn- Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-OH;
Х(2) H-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala-Ser- Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-OH;
Х(3) H-Tyr-Ser-Ser-Met-Pro-Pro-Leu-Glu-Gly-Glu-Pro-Gly- Asp-Pro-Asp-Leu-Ser-Asp-Gly-Ser-OH
при следующем соотношении компонентов, мас. Х(1) Х(2) Х(3) 17 - 22 7 9 68 70.