КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТА С Российский патент 1997 года по МПК A61K38/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике гепатита С.

В настоящее время для диагностики гепатита С используют пептидные композиции, способные обнаружить в крови пациента антитела к вирусу гепатита С. В частности, используется полипептид С-100-3, состоящий из 363 аминокислотных остатков, который разработан фирмами "Ortho" и "Abbott" /3/.

К недостаткам полипептида С-100-3 относятся трудность его получения, а также низкая специфичность, позволяющая диагностировать заболевание только в 50% случаев /2/, что обусловлено существованием нескольких генотипов вируса гепатита С, отличающихся по структуре своих геномов на 60 70%
Наиболее близким к заявляемому являются полипептиды, разработанные фирмой "Chiron" /1/. Пептиды состоят из 70 90 аминокислот и позволяют повысить специфичность анализа до 60 70%
Недостатком указанных полипептидов является трудность синтеза и недостаточная специфичность диагностикума, связанная с тем, что структура пептидов отвечает последовательности только некоторых, хотя и наиболее распространенных генотипов вируса, вызывающих гепатит С.

Задачей, стоящей перед авторами, являлось создание более эффективной пептидной композиции, обладающей более высокой селективностью.

Было найдено, что данная задача решается использование в композиции не менее одного из биотинсодержащих пептидов общей формулы Bt-X, где Bt биотин, Х один из пептидов:
X(I) -Thr-Asn-Pro-Lys-Pro-Glu-Arg-Lys-Thr-Arg-Arg-Asn-Thr -Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-OH,
X(II) -S er-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala -Ser-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-OH,
X(III) -Try-Ser-Ser-Met-Pro-Pro-Leu-Glu-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp -Pro-Asp-Leu-Ser-Asp-Gly-Ser-OH.

Лучшие результаты достигаются при использовании композиции указанных трех пептидов в весовом соотношении I:II:III=15-30:3-20:60-80.

Указанная композиция является дальнейшим усовершенствованием предыдущей разработки авторов (заявка на изобретение "Пептиды, взаимодействующие с антителами к вирусу гепатита С", N 93044257 от 8.09.93 г), позволяющим создать более универсальные пространственные структуры, способные взаимодействовать с антителами к различным генотипам вируса гепатита С. Причем найденное соотношение предложенных пептидов обеспечивает практически 100% выявляемость антител к вирусу гепатита С.

Пептиды Bt-X(I) Bt-X(III) получают общепринятым методами стандартного твердофазного синтеза на основе последовательного наращивания пептидной цепи на сополимере стирола с 1% дивинилбензолом. Для защиты боковых радикалов трифункциональных аминокислот использовали 2-хлорбензилоксикарбонильную, 2,6-дихлорбензильную и другие группы.

Анализы на эффективность пептидной композиции проводили при использовании 50 сывороток больных гепатитом С с помощью стандартного иммуноферментного анализа. Результаты испытаний показали, что процент выявления положительных проб с использованием только Bt-X(I) составляет 95% Bt-X(II) 45% Bt-X(III) 80% а их совместное использование обеспечивает 100% выявляемость.

Пример 1. Синтез пептида Bt-X(I).

Для синтеза пептила Bt-X(I) в реакционный сосуд загружают 5 г трет-бутилоксикарбонил-валинполимера. Содержание валина составляет 0,50 ммоль/г. Пептидную цепь далее наращивают по следующей программе (на присоединение одной аминокислоты) (см. табл. 1).

Если нингидриновый тест положителен, то конденсацию повторяют, начиная с п. 5. В случае отрицательного теста присоединение следующего аминокислотного остатка производят, начиная с п. 1 указанной программы.

После завершения синтеза пептидил-полимер высушивают в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы. 1 г пептидил-полимера переносят в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 1 мл тиоанизола и 1 мл мета-крезола, охлаждают до температуры минус 78^o C и в течение 10 мин перегоняют 10 мл безводного фтористого водорода. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25% уксусной кислотой, разбавляют в два раза водой. После обессоливания на колонке с Sephadex G-10 (элюент 50% уксусная кислота) продукт очищают на колонке Altech Rsil C18 в 0,1% трифторуксусной кислоте в градиенте 10-40% ацетонитрила. Фракции, содержащие пептид, собирают и лиофилизируют. Выход с 1 г пептидилполимера составляет 324 мг (79%).

Однородность пептида определяют по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке Delta PAC C18, (0,4 x 15,0) см со скоростью потока 1 мл/мин при элюции 0,1% трифторуксусной кислотой в градиенте 10 40% ацетонитрила. Время удерживания 6,44 мин.

Пример 2. Синтез пептида Bt-X(II).

Синтез, деблокирование, очистку и характеристику пептида Bt-X(II) осуществляют теми же способами, что и пептида Bt-X(I), за исключением того, что в реакционный сосуд загружают 5 г трет-бутилоксикарбонил-тозил-аргининполимера. Выход пептида после деблокирования 1 г пептидполимера составляет 384 мг (84%). Время удерживания в ВЭЖХ 7 мин.

Пример 3. Синтез пептида Bt-X(III).

Синтез, деблокирование, очистку и характеристику пептида Bt-X(III) осуществляют теми же способами, что и пептида Bt-X(I), за исключением того, что в реакционный сосуд загружают 5 г трет-бутилоксикарбонил-тозил-серилполимера. Выход пептида после деблокирования 1 г пептидполимера составляет 315 мг (76%).Время удерживания в ВЭЖХ 6,8 мин.

Пример 4. Иммуноферментный анализ сывороток с использованием отдельных пептидов, композиции из 3 пептидов Bt-X(I-III).

Синтезированные пептиды были использованы в твердофазном иммуноферментном анализе при исследовании сывороток от 50 здоровых доноров и 50 больных гепатитом С с целью обнаружения специфических антител. Предварительно сыворотки были проанализированы с помощью коммерческой скриннинговой ИФА тест-системой 2-ой генерации фирмы "Abbott" (Abbott HCV EIA 2,0, США).

Методика проведения ИФА включала следующие этапы:
1. Сорбция авидина на твердой фазе.

Авидин растворяют в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе (рН 9,5) до концентрации 5 мкг/мл. Полученный раствор вносят по 0,1 мл во все лунки 96-луночного планшета и инкубируют при температуре (4 6)^o C в течение 18 24 ч. Затем лунки промывают 1 раз фосфатно-солевым буферным раствором рН 7,2, содержащим 0,05% твина-20 (ФСБТ).

2. Получение иммуносорбента.

Пептиды растворяют в ФСБТ и готовят следующие растворы пептидов (см. табл. 2).

Растворы вносят в лунки планшетов с сорбированным авидином (стрептавидином) и инкубируют при (4 6)^o C в течение 24 ч. Затем лунки промывают 1 раз раствором ФСБТ.

3. Связывание антител с иммуносорбентом (получение комплекса /-Аг-Ат)
Сыворотки крови, разведенные предварительно в 20 раз на ФСБТ, вносят в лунки планшета по 0,1 мл и инкубируют при 37^oС в течение 20 мин. Затем лунки промывают 3 раза раствором ФСБТ.

4. Связывание универсального конъюгата (белок А пероксидаза) с комплексом на твердой фазе (образование комплекса /-Аг-Ат-Конъюгат).

В лунки планшета вносят по 0,1 мл раствора конъюгата (коммерческий препарат, производства предприятия бакпрепаратов НИИЭМ им. Пастера) в разведении 1: 20 на ФСБТ. Планшет инкубируют при 37^oС в течение 20 мин, затем промывают 5 раз раствором ФСБТ.

5. Выявление комплекса /Аг-Ат-Конъюгат/.

В лунки планшета вносят по 0,1 мл раствора субстратной смеси, состоящей из 0,05% орто-фенилендиамина, 0,005% перекиси водорода в 0,05 М фосфатно-цитратном буферном растворе, рН 5,0. Планшет инкубируют 15 мин при температуре (15 25)^oС.

6. Остановка реакции и учет результатов.

В лунки планшета добавляют по 0,05 мл 2 М раствора серной кислоты. Учет результатов осуществляют с помощью вертикального фотометра "Minireader-11" при длине волны 490 нм.

В качестве обязательного контроля для исключения неспецифических результатов при постановке реакции с каждым составом пептидов используют контроль субстратной смеси (пептиды + субстрат), контроль конъюгата (пептиды + конъюгат + субстрат), контроль сыворотки, не содержащей антител к вирусу гепатита С (НК) по данным тестирования в скрининговых зарубежных тест-системах 2-ой генерации (Liatek HCV, Organon Teknika, Нидерланды).

Исследуемую пробу считают реагирующей с пептидами специфично, если оптическая плотность (ОП) раствора в лунках с исследуемой сывороткой превышала контрольный уровень (КУ), рассчитываемый по формуле:
КУ=0,1+ОП(НК),
где ОП(НК) оптическая плотность для НК.

При ОП исследуемой пробы больше КУ пробу считают содержащей антитела к вирусу гепатита С.

Результаты эксперимента представлены в табл. 3.

Результаты проведенных испытаний показали высокую эффективность, как новых пептидов, так и их смесей.

Предлагаемая смесь пептидов обеспечивает практически 100% диагностику заболевания гепатитом С.

Выпуск нового диагностикума осуществляется в ТОО "Аквапаст".

Использование: медицина, для диагностики гепатита С. Используют пептиды, взаимодействующие с антителами к вирусу гепатита С. Сущность изобретения: в качестве антигенов в диагностических тест-системах, в непрямом варианте иммуноферментного анализа. Пептиды формулы Bt-x (I-III) получают в твердофазном синтезе с последовательным наращиванием пептидной цепи на сополимере стирола с 1% дивинилбензолом. Эффективность предложенной композиции и отдельных пептидов проверяли в непрямом варианте иммуноферментного анализа с сыворотками больных гепатитом С и здоровых доноров. Синтезированные пептиды в различной степени реагируют с сывороткой больных. Их композиция, взятая в весовом соотношении Bt-X(I): Bt-x(II): Bt-x(III)=15-30:3-20:60-80, обеспечивает 100% выявляемость сывороток больных гепатитом С при 100% специфичности. Структурный состав пептидов: x(I) Thr-Asn-Pro-Lys-Pro-Glu-Agr-Lys-Thr-Arg- Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-OH;
x(II) Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala -Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-OH;
x(III) Tys-Ser-Ser-Het-Pro-Pro-Len-Glu-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp -Pro-Asp-Len-Ser-Asp-Gly-Ser-OH. 3 табл.

1. Композиция для диагностики гепатита С, включающая пептидные антигены, взаимодействующие с антителами к вирусу гепатита, отличающаяся тем, что в качестве антигенов композиция содержит пептиды общей формулы
В х,
где В биотин
Х(1) Thr-Asn-Pro-Lys-Pro-Glu- Arg-Lys-Thr-Arg-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg- Pro-Gln-Asp-Va-OH, или
Х(2) Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln- Pro-Jle-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-OH, или
Х(3) Tyr-Ser-Ser- Mef-Pro-Pro-Leu- Glu-Gly-Glu- Pro-Gly-Asp-Pro-Asp-Leu-Ser-Asp-Gly-Ser- OH
при следующих весовых соотношениях
х(1) 15 30% Bt
х(2) 3 20% Bt
х(3) 60 80% Bt