Способ определения активности каталазы в плазме крови Советский патент 1991 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к биохимии и медицине и может быть использовано в эксперименте и клинике для определения активности каталазы плазмы крови.

Цель изобретения - сокращение времени и создание возможности определения активности каталазы в плазме при гипербилирубинемии.

Способ осуществляется следующим образом.

Венозную кровь(3 мл) центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, при этом в. качестве антикоагулянта используют гепарин из расчета 50 ЕД/мл крови, Для приготовления стандартного образца к 0,1 мл плазмы крови добавляют 0,1 мл раствора азида натрия 0,2-2%- ной концентрации и 2 мл 0,03%-ного

раствора перекиси «одорода (Нг02). В исследуемой пробе к 0,1 мл плазмы крови добавляют 2,0 мл 0,03%-ного раствора . Обе пробы ставят на инкубацию при 25°С на 55-60 с, После минутного инкубирования в исследуемую пробу добавляют О,1 мл раствора азида натрия 0,2-2/Ј-ной концентрации с целью ингибирования реакции разложения H20jj каталазои плазмы крови (конечная концентрация азида 0,009-0,09%). В стандартную и исследуемую пробы вносят 1,0 мл 4%-ного раствора молиб- дата аммония, который с непрореагиро- вавшей Н2О2 образует окрашенный комплекс Интенсивность цветной реакции измеряют спектрофотометрически на приборе Specol 21 (BIIP) при длине волны 410 нм. Определяют разницу экстинко

1C ГС

00

к

ции между стандартной и опытной пробами и производят расчет активности каталазы плазмы крови по формуле .

UE-M-K ,

А

где А - активность каталазы, мкмоль -с л ;

ДЕ - разность экстинкций контрольной и опытной проб;

V - объем пробы, мл (3,2);

К - коэффициент пересчёта на 1 л

ллазмы крови (10000); Ј - коэффициент молярной экстинкций перекиси водорода, мкмоль (22,2); t - время инкубации проб, с (60).

Для определения оптимальной инги- бирующей концентрации азида натрия (в 0,1 мл раствора) проведено исслеование, результаты которого показывают, что 0,2%-ный раствор азида натрия обладает максимальной ингиби- рующей способностью и превышение указанного верхнего предела концентрации азида натрия не приводит к большему угнетению активности фермента, а влечет повышенный расход данного реактива. Использование концентраций азида натрия меньше 0,2% приводит к снижению ингибирования каталазы. Следовательно, 0,2-2%-ный раствор азица натрия является оптимальной концентрацией данного вещества в целях достаточного угнетения каталазы плазмы крови (конечная концентрация азида 0,009-0,09%).

Проведенное изучение выраженности ингибирующего эффекта азида натрия показывает, что полная каталазная активность плазмы крови (без добавления азида натрия) равна 0,50 + . + 0,06 мкмоль л а остаточная (после добавления 0,2-2%-ного раствора азида натрия) 0,016 + +. 0,003 мкмоль-с - л что составляет 3,34% от полной. Следовательно, выраженность ингибируюгцего эффекта азида натрия на каталазу плазмы крови достигает 96,66%.

Для выбора оптимального времени инкубации изучена кинетика активности каталазы. Линейная зависимость активности фермента от времени инкубации сохраняется в течение 55-60 с, При дальнейшем увеличении времени инкубации скорость разложения перекиси водорода каталазой плазмы крови постепенно снижается,, Сокращение времени инкубации менее 55 с ведет к уменьшению разницы экстинкций контрольной и опытной проб, а при увеличении врь- мени инкубации более 60 с зависимость активности каталазы от времени инкубации теряет линейный характер.

Пример 1. 3 мл венозной крови

практически здорового человека (общий билирубин 14,7 мкмоль/л), взятой с использованием гепарина из расчета 50 КД/мл, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Полу5 ченную плазму крови отсасывают в чистую пробирку. Для приготовления стандартного образца к 0,1 мл плазмы добавляют 0,1мл 0,2%-ного раствора азида натрия (конечная концентрация

0,004) и мл 0,03%-ной перекиси водорода. В исследуемой пробг к 0,1 мл плазмы крови - 2,0 мл 0,031-ного раствора перекиси водорода (). Обе пробы ставят на инкубацию при (

на 60 с. После выдерживания 1 мин при этой температуре в исследуемую пробу добавляют 0,1 мл 0, раствора азида натрия. Затем как а стандартную, так и и исследуемую пробы

д вносят по I , U мл 4/о-но о раствора мо- лгбдята аммония. После 2-минутного центрифугирования при 3000 об./мин измеряю экстинкцию стандартном и опытной проб на спектрофотометре Specol 21 (ВНР) при длине волны 410 нм. Разница экстинкций ( Д1 ) между контрольной и опытной пробами в конкретном случае равна 0,042. Используя указанную формулу, определяют акQ тивность каталазы плазмы крови:

. AK-V-K-1 -1

А р 1,009 мкмоль С «л .

II р и м е р 2. Взятие крови и полу- 5 чение плазмы крови здорового человека проводят идентично примеру 1. Для приготовления стандартной пробы к 0,1 мл плазмы крови добавляют 0,1 мл 1%-ного раствора азида натрия (ко- д нечная концентрация 0,) и 2,0 мл 0,03%-ного раствора . Исследуемую пробу готовят как в примере 1, Обе пробы ставят на инкубацию при 25 С на 58 с. После инкубации в исследуемую пробу добавляют 0,1 мл 1%- ного раствора азида натрия. Затем в стандартную и опытную пробы вносят по 1,0 мл 4%-ного раствора молибдата . аммония. Последующие опррацни прово5

лцят как в примере 1, Разница экстинк- ций между стандартной и исследуемой пробами в данном случае 0,040. Активность каталаэы плазмы крови

А

. К E7t

0,994 мкмоль-с

Пример 3. У здорового челове129,4 мкмоль/л) проводят забор крови и выделяют плазму как в примере 1. 1пя приготовления стандартной пробы 5 к 0,1 мл плазмы крови добавляют 0,1мл 1%-ного раствора азида натрия и 2,0 мл 0,03%-ного раствора H,j02 , Исследуемую пробу готовят как в примере 1. Обе пробы ставят на инкубацию при на

ка проводят забор венозной крови и вы-Ю 58 с. После инкубации в исследуемую деляют плазму как в примере 1. Дляпробу добавляют О,1 мл 1%-ного раствоприготовления стандартной пробы к 0,1 мл плазмы крови добавляют 0,1 мл 2%-ного раствора азида натрия (конечная концентрация 0,09%) и 2,0 мл 0,03%-ного раствора . Исследуему пробу готовят как в примере 1. Обе пробы ставят на инкубацию при 25 С, на 55 с. После инкубации в исследуемую пробу добавляют 0,1 мл 2%-ного раствора азида натрия. В стандартную и опытную пробы вносят по 1,0 мл 4%-ного раствора молибдата аммония. Последующие операции проводят как в примере 1. Разница экстинкций между стандартной и исследуемой пробами в данном случае 0,ОЗЙ. Активность ка- талазы плазмы крови

А

ДЕ. у.к Ј-с

0, 99t мкмоль -с

И р и м е р 4. У больного стедне- тяжелой формой вирусного гепатита В (общий билирубин плазмы крови 129,4 мкмоль/л) проводят забор крови и выделение плазмы способом, описанным в примере 1. Для приготовления стандартной пробы к О, 1 мл плазмь. крови добавляют 0,1 мл 0,2/-ногораствора азида натрия и 2,0 мл 0,03%-но- го раствора Н202. Исследуемую пробу готовят как в примере 1. Обе пробы ставят на инкубацию при 25 С на 60 с. После инкубации в исследуемую пробу добавляют 0,1 мл 0,2%-ного раствора азида натрия. В стандартную и опытную пробы вносят по 1,0 мл 4%-ного раствора молибдата аммония. Последующие операции проводят как в примере 1. Разница экстинкцми между стандартной и опытной пробами в данном случае 0,08. Активность каталазы плазмы крови

А

UE- ----1,92 мкмоль с

ИримерЗ. У больного средне- тяжелой формой вирусного гепатита В (общий билирубин плазмы крови

129,4 мкмоль/л) проводят забор крови и выделяют плазму как в примере 1. 1пя приготовления стандартной пробы 5 к 0,1 мл плазмы крови добавляют 0,1мл 1%-ного раствора азида натрия и 2,0 мл 0,03%-ного раствора H,j02 , Исследуемую пробу готовят как в примере 1. Обе пробы ставят на инкубацию при на

ра азида натрия. В стандартную и опытную пробы вносят по 1,0 мл 4%-ного раствора молибдата аммония. Последу- ющие операции проводят как в примере 1. Разница экстинкций между стандартной и опытной пробами в данном случае 0,077. Активность каталазы плазмы

крови

1,91 мкмоль -с

-I

л

II р и м е р 6. У этого же больного проводят взятие крови и получение

плазмы крови как в примере 1. Для приготовления стандартной пробы к 0,1 мл плачмы крови добавляют 0,1 мл 2%-ного рлствора атида натрия и 2,С мл 0,03%-ного раствора . Исследуемую

пробу готовят как в примере 1. Обе пробы ставят на инкубацию при 25 С на 55 с. После инкубации в исследуемую пробу добавляют О, 1 мл 2%-ного раствора лчида натрия. Затем в обе

пробы внос.т по 1,0 мл 4%-ного раствора молиОдата аммония. Последующие операции осуществляют как в примере 1. Разница экстинкций между стандартной и исследуемой пробами в данном случае 0,073, что позволяет определить активность каталазы плазмы крови:

А

йк -у-к

е

1,91 мкмоль-с л

Используя известный и предлагаемый способы изучена активность каталазы крови больных вирусным гепатитом В (ВГВ) различной степени тяжести и

50 практически здоровых доноров в сопоставлении с уровнем билирубинемии. Исследования, аналогичные предлагаемому способу, проведены с использованием и других известных ингибиторов

55 каталаэы.i

Результаты определения активности данного фермента с применением в качестве ингибиторов азида натрия и цианида калия приведены в таблице.

Полученные данные свидетельствуют о практической идентичности активности каталазы в одинаковых группах обследованных лиц при использовании различных ингибиторов предлагаемого способа (учитывая очень высокую токсичность цианида калия, в лаборатор- .ной практике следует отдать предпоч- (. тение азиду натрия) .

Используя предлагаемый способ в плазме крови больных ВГВ средней и -тяжелой формами активность каталаэы была значительно повышенаf однако при известном способе такого повыше- ния обнаружено не было, что указывает на неадекватность известного технического решения,

Существенно, что у отдельных больных с высокой-билирубинемией опреде- лить активность каталазы плазмы крови известным способом оказалось невозможным, что подтверждается следующим наблюдением.

Пример. Больная Ч., 48 лет, находилась на лечении в Гродненской областной инфекционной больнице в 1988 году. Биохимическое исследование крови показало, что уровень обгде- го билирубина равен 260 ммоль/л-ч (норма - до 20,5), активность аланин- аминотрансферазы 4,5 ммоль/л ч (норма - до 0,7), обнаружен поверхностный антиген вируса гепатита В. Поставлен диагноз: вирусный гепатит В, тяжелая формас При использовании известного способа определение активности каталазы провести не удалось, поскольку экстинкция (0,475) холостой пробы (с максимальной концентрацией окрашенног

комплекса перекиси водорода с молиб- датом аммония) оказалась меньше экстинкции опытной пробы (0,), содержащей плазму крови больной Ч. Однако предлагаемым способом активность каталазы была успешно определена (2,16 мкмоль-с ч л ).

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает по сравнению с известным сокращение срока инкубации в 10 раз, тем самым в 3 раза уменьшая длительность определения, более высокую специфичность и адекватность исследования1 за счет создания возможности определения активности каталазы в плазме крови при гипербилирубинемии.

Формула изобретения

Способ определения активности каталазы в плазме крови путем инкубации контрольной пробы, содержащей перекись водорода, и опытной пробы, содержащей плазму и перекись водорода, с последующим добавлением к обеим пробам молибдата аммония и регистрацией оптической плотности, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени при одновременном создании возможности определения при гипербилирубинемии, в контрольную и опытную пробы дополнительно вводят азид натрия в конечной концентрации 0,009-0,09%, причем в контрольную про бу азид натрия вводят перед началом инкубации, в опытную пробу - после окончания инкубации перед введением молибдата аммония, а инкубацию проводят в течение 55-60 с.

Изобретение относится к биохимии и медицине и позволяет определять активность каталазы плазмы крови в норме и при гипербилнрубинемин. Цель изобретения - сокращение времени определения при одновременном создании возможности определения активности ка- талаэы в плазме при гнпербнлирубине- мии. Готовят стандартную и исследуемую пробы. В стандартную пробу к плазме крови добавляют в конечной концентрации 0,009-0,09%-ный растпор азида натрия и перекись водорода, а з исследуемую пробу - перекись водорода. После инкубации в течение 55-60 с в исследуемую пробу плазмы крови вносят азид натрия, а затем в обе пробы - молибдат аммония. Спектрофотометричес- ки определяют разность экстинкций и рассчитывают активность каталаэы плазмы крови. КЛ

16,5+3,1 0,56+0,06

41,2+9,65 0,84 + 0,07

1,01+0,07 1,44+0,09

0,98+0,0/ 1,39+0,08

41,2+9,65 0,84 + 0,07

114,6+17,3 192,4+21,7 0,35+0,06 0,03+0,004

1,9110,13 2,4210,18

1,92 + 0,15 2,5Ц-0,20