Способ определения активности креатинфосфокиназы в крови Советский патент 1989 года по МПК G01N33/70 

1

Изобретение относится к биохимичес- КИМ исследованиям в медицине и может : быть использовано в клинической практике как основной биохимический тест в диагностике инфаркта миокарда в ранние сроки.

Целью изобретения является повьнпе- ние точности и чувствительности и упрощение способа.

Цель достигается путем проведения реакции сыворотки крови с реагентом, включающим креатин, АТФ, буферный раствор и унитиол, остановки реакции раствором молибдата аммония в серной кислоте, проявления фосфора раствором аскорбиновой кислоты в соляной кислоте, растворения денатурированного белка добавлением гидрата окиси натрия.

Способ осуществляется следующим образом.

В две пробирки (опытную и контрольную) вносят по 0,05 мл сыворотки или плазмы. Добавляют в каждую по 0,2 МП раствора свежеприготовленной

субстратной смеси, включающей 8,35мМ АТФ и 5,3 мМ унитиола в 0,15 М трисок- симетиламинометана, содержащего 11,3 магния ацетата. Ставят на водяную баню с температурой 37 С. Через 3 мин в опытную пробирку вносят О,t мл 86,3 мМ раствора креатина. Продолжают инкубацию в течение 30мин. Реакцию останавливают добавлением в обе пробирки по 1 МП 0,6%-ного молибдата аммония в 0,4 М серной кислоте, после чего в контрольную пробирку вносят 0,1 мл 86,3 ъМ раствора креатина. Последукяцие операции проводят при комнатной температуре. Через 15 мин в обе пробирки вносят по 1 мл свежеприготовленного 1%-ного раствора аскорбиновой кислоты в 0,1 М соляной кислоте. Ровно через 15 мин, соблюдая ту же последовательность, в пробирки вносят по 2 мл 1 М раствора гидрата окиси натрия. Пробирки встряхивают ДО растворения денатурированного белка. Через 15 мин прозрачные однородные растворы подвергают поочесл

4ib

о ю

ГС

рвдной колориметрии. Применяя фото- электроколориметр с красньгм светофильтром или спектрофотометр при длине полны в 625 нм, в односантиметровых кюветах определяют степени поглощения светового луча в растворах. Ойределяют разницу показаний между опытным и контрольным растворами. По калибровочному графику, представляю- собой зависимость степени пог- лбщения светового луча заданной дли- mi волны от количества фосфора в рас вррах различных концентраций одноза- мфщенного фосфата натрия, определяют количественное содержание фосфора, образовавшегося из синтезированного к еатинфосфокиназнЬй креатинфосфата вiпроведенной реакции. Активность кфеатинфосфокиназы выражают в микро- фосфора в 1 л сыворотки или плазмы за 1 мин, учитьшая количест- соотношения.

j Для подтверждения более высокой эффективности предлагаемого способа В: сравнении с известным бьшо проведе HJ3 исследование одной пробы крови б|)льного К.; с целью исключения ошибок в анализе проведено по 10 определений каждым способом.

Активность креатинфосфокиназы, ойределенная предлагаемым способом составила 98; % } 95; 98; 94; 98; 100; 97; 96; 95; т.е. в среднем 96 мкмоль/л в 1 мин.

Активность креатинфосфокиназы, определенная известным способом составила 67; 80; 56; 69; 78; 73: 79; 67; 51; 78, в среднем 70 мкмоль-/л в t мин.

Средтше цифровые показатели активности креатинфосфокиназы, определенной предлагаемым способом, на 37% выше показателей, определенных известным способом. Следовательно, чувствительность предлагаемого спо-; соба выше,

Показйт€шь воспроизводимости способов определяется при анализе азброса цифровых значений отдельных определений в обоих способах относительно их средних значений. Показатель воспроизводимости результаг- тов предлагаемого способа составляет

1,6%, известного 11,4%.

Формула изобретения

Способ определения активности

креатинфосфокиназы в крови путем инкубации сыворотки крови в щелочной среде, содержащей трис-НС1 буффер, креатин, АТФ, сульфат магния и донор сульфгидрильных групп, остановки

реакции образования креатинфобфата, гидролиза его в кислой среде, проявления фосфора восстановителем и определения фосфора, отличающий- с я тем, что, с цепью повышения

точности и чувствительности способа, в качестве донора сульфгидрильных групп используют унитиол, остановку

реакции и гидролиз креатинфосфата проводят одновременно добавлением

молибдата аммония в 0,4 М серной кислоте, фосфор проявляют раствором аскорбиновой кислоты в соляной кислоте, затем через 15 мин после развития цветовой реакции растворяют денатурированный белок добавле7 нием 1N гидрата окиси натрия с последующим определением фосфора.

Изобретение относится к способам ранней диагностики инфаркта миокарда. Цель - повьппение точности, чувствительности и упрощение способа достигается за счет инкубации сьшо- ротки крови в присутствии креатина, АТФ, унитиола и буферного раствора, обработки смеси последовательно раствором молибдата аммония в серной кислоте, раствором аскорбиновой кислоты в соляной кислоте, растворения полу- . ценного осадка щелочью и колориметрии при 625 нм. Чувствительность способа 70 мкмоль/л, ошибка способа 1,6 %.