Способ определения желчных кислот в биологической жидкости Советский патент 1991 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к биохимии и применимо для изучения обмена желчных кислот в организме животных и при физиологических исследованиях функционального состояния гепатобилиарной системы, а также может быть использовано в медицине для диагностики и контроля за ходом лечения при заболеваниях печени.

Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способа.

Цель достигается тем, что экстрагирование желчных кислот из биологического материала проводят при (-10-0°С) смесью этанола с ацетоном (1:3). Последнее позволяет сохранять тауроконЪюгаты и уменьшить примеси липидного характера в пробах.

Хроматографическое разделение свободных и конЪюгированных желчных кислот проводят в системе, включающей амиловый

эфир уксусной кислоты, толуол, бутанол, уксусную кислоту и воду в соотношении (3:1:1:3:1), которая позволяет одновременно разделить свободные и конъюгированные желчные кислоты при одномерной хроматографии на стандартных пластинах Silufol. Это сокращает время хроматогра- фического анализа и уменьшает расход материалов и реактивов. Количественную оценку содержания каждой желчной кислоты проводят после опрыскивания хроматограмм 5%-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в смеси, включающей ледяную уксусную кислоту, концентрированную серную кислоту и 50%- ный раствор трихлоруксусной кислоты при соотношении 15:1:5. Это позволяет проявлять при 60-70°С без изменения фона. Чувствительность метода 0,25-0,35 мкг для каждой свободной или кон ьюгированной желчной кислоты, что более чем в два раза

45 Јь W

ю

NJ

превышает чувствительность способа прототипа

Способ осуществляется следующим образом.

0,1 мл желчи или 0,2 мл цельной крови человека или животного внослт в стеклянную центрифужную пробирку, в которую предварительно налито соответственно 1,9 или 1,8 мл охлажденной экстрагирующей смеси этанола с ацетоном (1:3). Дуоденаль- ное содержимое сперва необходимо гомогенно диспергировать в дистиллированной воде (разведение в 2 раза), а затем 0,5 мл взвеси внести в пробирку, где ранее налито 4,5 мл указанной смеси органических растворителей. После тщательного перемешивания стеклянной палочкой содержимого пробирки ставят в морозильное отделение холодильника на 25-30 мин. Затем пробы центрифугируют 10-12 мин при 3000- 4000 об/мин,сливают экстракт в конусовидные стеклянные пробирки и упаривают при 37-40°С под вытяжным шкафом до сухого остатка (процесс можно ускорить с помощью вакуум-шкафа) Сухой остаток растворяют в смеси этанола с водой (6:4) в зависимости от исследуемого биологического материала в 10-20 мкл при анализе крови или 50-100 мкл при исследовании желчи.

Исследуемые вытяжки по 5 или 10 мкл наносят на предварительно промытые и размеченные хроматографические листы. Хроматографическое разделение свободных и кон ъюгированных желчных кислот осуществляется в системе амиловый эфир уксусной кислоты,толуол,бутанол,уксусная кислота и вода (в соотношении 3:1:1:3:1) в стеклянных прямоугольных камерах. Одномерная хроматография позволяет на хрома- тографической пластине 15x15 см провести 8-9 анализов.

Для количественного определения содержания отдельных желчных кислот с помощью денситометра в отраженном свете ( Я -620 нм) - пятикратное опрыскивание хроматограмм из мелкодисперсного стеклянного пульверизатора следующим красителем: 15 мл ледяной уксусной кислоты, 1 г фосфорномолибденовой кислоты, 1 мл серной кислоты и 5 мл 50%-ного раствора трих- лоруксусной кислоты. Хроматограммы проявляли при в течение 5 мин.

В табл. 1 представлены данные о содержании желчных кислот в желчи и крови человека, полученные при определении способом Громашевской и др. и предлагаемым способом. Из этих данных видно, что при определении содержания желчных кислот в желчи методом Громашевской и др.

количество тауроконЪюгатов уменьшено на 23,6%, но в сумме возросло на 26,7% содержание свободных желчных кислот.

Для сравнения чувствительности и точ- ности способа со способом-прототипом представлена табл. 2 о зависимости между количеством нанесенной на хроматограмму желчной кислоты и цифровыми показателями с интегратора денситометра GP-920

0 (Шимадзу, Япония), в которых одновременно учтена интенсивность поглощения света ( Д-620) окрашенным пятном, величина его площади и вычтено поглощение исходного фона на равной площади пятна. Данные

5 приведены на примере холевой кислоты.

Результаты исследований по влиянию температурных режимов на экстракцию желчных кислот приведены в табл. 3.

Приведенные в табл. 3 данные, в част0 ности по суммарному содержанию желчных кислот, показывают, что предложенная смесь органических растворителей при 10- 20-кратном разведении исследуемой желчи практически одинаково экстрагирует желч5 ные кислоты во всех исследуемых температурных режимах и обладает высокой депротеинизирующей способностью. Вместе с тем при экстракции в условиях физиологического и комнатного температурных

0 режимов в экстракте желчных кислот присутствовала в значительных количествах примесь органического компонента (скорее всего липидного характера), которая на тонкослойных хроматограммах затрудняла

5 прямое определение содержания гликохо- левой кислоты и необходимо было прибегать к косвенным расчетам для этой кислоты. Экстрагирование охлажденной смесью органических растворителей в усло0 виях нижнего отделения холодильника вело к снижению содержания примеси до уровня, который позволил прямо определять концентрацию гликохолевой кислоты, а при экстракции в условиях низкотемпературно5 го морозильного отделения холодильника эта примесь практически не попадала в экстракт желчных кислот. Последние условия экстракции желчных кислот (-10°-0°С) определены как оптимальные и легковоспроиз0 водимые в любой лаборатории,

Предлагаемый способ позволяет в сравнении с прототипом повысить более чем в два раза чувствительность (обнаруживает 5 0,25-0,35 мкг желчной кислоты на хроматог- рамме, в то время как в прототипе около 1 мкг исследуемых кислот); высокая чувствительность способа позволяет применить его в микроисследованиях, при этом не требуется внутривенный отбор крови, так как для

анализа необходимо не более 0.2 мл цельной крови, которую можно взять из пальца

Формула изобретения Способ определения желчных кислот в биологической жидкости путем экстрагирования их из исследуемого материала, концентрирования и хроматографического разделения экстракта на силикагеле. окрашивания хроматограмм раствором фосфор- номолибденовой кислоты с последующей денситометрией, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и чувствительности способа, экстракцию проводят

смесью этанола с ацетоном при их объемном соотношении 1,3 при температуре -10- 0°С, концентрирование осуществляют при 37-40°С, при хроматографическом разделении в качестве растворителя используют систему, содержащую амиловый эфир уксусной кислоты, толуол, бутанол, уксус- кую кислоту и воду при их соотношении (3.1:1:3:1), а окрашивание хроматограмм проводят 5%-ным раствором фосфорномо- либденовой кислоты в смеси ледяной уксусной, концентрированной серной и 50%-ной трихлоруксусной кислот, взятых в соотношении 15:1:5 (по обьему).

Таблица 1

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения желчных кислот в биологических жидкостях. Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способа. Способ включает экстрагирование желчных кислот из биологического материала при пониженных температурах и смесью этанола с ацетоном

Таблица 2

Таблица 3