Способ выделения мононуклеаров из крови человека Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и моле т быть использовано при лабораторных исследованиях для определения характеристик фракций крови.

Цель изобретения - повы11 -. ние чистоты целевого продукта за счет снижения примеси тромбоцитов.

Пример. Кровь смешивают с антикоагулянтом, центрифугируют 10 мин при 180g, отбирают плазму. Оставшийся клеточный осадок разводят в 2-5 раз изотоническим раствором, содержащим гепарин в количестве 100 ед/мл,и наслаивают на градиент плотности d 1,077 г/см (1 объем градиента на 2-4 объема суспензии), в который также вносят гепарин в том же соотношении, после чего клеточную, суспензию центрифугируют. Центрифугирование осуществляют при 400g в течение 14 мин. Полученную фракцию (кольцо) мононуклеаров отсасывают в другую пробирку и отмывают фосфатным буфером или раствором Хеккса.

П р и м е р 2. Донор П.А.Н., 1961 г.р. Из двух проб крови объемом 0,3 мл выделяют в градиенте плотности с добавлением 25 ед/мл гепарина при длительности центрифугирования 12;18 мин 2,4 и 2,2 млн мононуклеаров. Примесь эритроцитов, тромбоцитов, полиморфоядерных лейкоцитов в отобранной фракции составила 14/250/0,3 и 16/220/0,5 на 100 мононуклеаров.

П р и м е р 3. Донор Н.А.А., 1960 г.р. Из пробы крови объемом 0,2 мл выделено 2,91 млн мононуклеаров.

Примесь эритроцитов, тромбоцитов и полиморфоядерньпс лейкоцитов составляет 17/250/0,3 на 100 мононуклеась

N3 J

СО

00

со

ров. Полученная взвесь мононуклеаров была нгпользована в микролимфоцито- токсическом тесте. Определены HL А А2,19; В 7,12; С бланк.

1

При использовании в этом-же тесте взвеси мононуклеаров, полученных известным способом, определены HLA А 2, 19; В 7,12; С бланк. В двух из девяти лунок с антисыворотками против антигена А2 при использовании мононуклеаров, содержащих большие количества примеси тромбоцитов (2000 на 100 мононуклеаров), зарегистрировано снижение интенсивности цитотоксичес- рсой реакции (с 4х + до 2х +). Примесь тромбоцитов в полученных предлагаемым способом взвесях мононуклеаров составляет 220-250 на 100 мононуклеаров, в полученных известным спо- собом - 18001200.

0

0

5

Формула изобретения

Способ выделения мононуклеаров из крови человека путем забора пробы крови, разведения ее изотоническим раствором и выделения продукта в градиенте плотности центрифугированием, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта за счет снижения примеси тромбоцитов, из пробы крови отделяют плазму центрифугированием, разведение изотоническим раствором с добавлением 25-100 ед/мл гепарина применяют для клеточной фракции, такое же количество гепарина добавляют в градиент плотности, а центрифугирование осуществляют в течение 12- 18 мин.

Изобретение касается иммунологии и может быть использовано при исследованиях клеток крови. Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта за счет снижения примеси тромбоцитов. Способ осуществляют посредством разведения клеточной фракции крови изотоническим раствором с добавлением гепарина и разделения клеток в градиенте плотности с добавлением того |же количества гепарина. Достигается примерно 10-кратное снижение примеси клеток тромбоцитов по сравнению с известным способом, что существенно повышает точность иммунологических тестов целевого продукта.