Способ определения иммунопатологического состояния организма, связанного с нарушением В-клеточного звена иммунитета Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано в сложных диагностических случаях, а также в случаях подозрения на иммунопатологию, характерную для аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний.

Целью изобретения является повышение точности диагностики.

Способ осуществляют следующим образом.

Из периферической крови обследуемых пациентов выделяют мононуклеары (МК) центрифугированием гепаринизированной венозной крови (100 ЕД гепарина на 1 мл крови) в градиенте плотности фиколла-верографина (плотность 1,077) при 800 д. 5х10б МК в среде 199, дополненной 10%-ной фе- тальной телячьей сыворотки ), обрабатывают митС (Sigma) в дозе Ю мкг/мл в течение 45 мин при 37°С Затем клетки троекратно отмывают в среде 199 и ресуспен- дируют в среде культуральной RPMI- 1640, дополненной 0,3 мг/мл 1-глютамина, 2 мМ Hepes-буфера, 100 мгк/мл гентамицина и 10% ФТС Необработанные и обработанные митС МК (0,2х106/лунку) культивируют в круглодонных лунках планшетов лгч иммунологических исследований при 37°С в С 02-инкубаторе. Интенсивность секреции иммуноглобулинов (ИГ) определяют на 7-е сутки методом иммуноферментного зналио

00 О

GJ О (Л

за (ИФА). Для этого 96-луночные плоскодонные планшеты (Flow) обрабатывают раствором бараньих антител против L-цепей ИГ человека (10 мкг/мл) в 0,01 М карбонатном буфере (рН 8,6-9,0) в объеме 0,1 мл/лунку в течение 4-5 ч при 37°С во влажной атмосфере. Далее планшеты троекратно отмывают фосфат забуференным физиологическим раствором (ЗФР, рН 7,2). Для предотвращения неспецифического связывания планше- ты обрабатывают 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА, Sigma) в 0,01 М карбонатном буфере в объеме 0,15 мл/лунку в течение 16-18 ч при 4°С во влажной камере. После этого планшеты троекратно отмывают раствором 0,05 % - ного твина (Tween 20, Ferak). Исследуемые культуральные супернатанты разводят 1:4 в ЗФР, содержащем 0,05% твина, перед внесением в лунки планшет для иммунофер- ментного анализа. Одновременно готовят калибровочные разведения эталонной сыворотки человека (от 1600 до 12 нг/мл) в аналогичном растворе. Супернатанты и эталонную сыворотку вносят в объеме 0,1 мл/лунку и инкубируют 1-2 ч при 37°С. Планшеты отмывают 5 раз 0,05%-ным раствором твина. Далее в лунки вносят конъю- гированные с пероксидазой хрена антитела против L-цепей ИГ человека (0,1 мл/лунку) в разведении 1:750. Инкубацию проводят при 37°С в течение 1-2 ч, после чего планшеты отмывают 10 раз 0.05%-ным раствором твина. Ферментативную активность перокси- дазы в образовавшихся комплексах определяют добавлением в лунки по 0,1 мл субстратного раствора, приготовленного следующим образом: 1,2-фенилдиамин (10 мг на 1 мл метилового спирта) разводят в 0,05 М цитратном буфере (рН 4,6) в соотно- шении 1:99 и к 100 мл указанной смеси добавляют0,01 мл 33%-ного раствора перекиси водорода. После инкубации в течение 10-15 мин при комнатной температуре цветовую реакцию останавливают добавлени- ем в лунки по 0,05 мл 50%-ной серной кислоты. Фотометрию проводят на аппарате Мультискан (Flow) при длине волны 472 нм. Концентрацию ИГ (нг/мл) определяют, откладывая среднее значение оптической плотности из трех идентичных образцов на прямом отрезке калибровочной кривой.

О наличии иммунопатологического состояния судят по величине остаточного ИГ- синтеэа. оассчитанной по формуле

ИГ-синтаэ {нг/мл) культурах митС- обработанных МК

ИГ-синтеэ (нг/мл) е культурах МК, необработанных митС 100%

При величине более 7% судят о наличии активированных В-лимфоцитов, характерных для иммунопатологического процесса.

Пример 1. Больной Г., 27 лет, поступил в нефрологическое отделение. При поступлении жалоб не предъявлял. Из анамнеза в июле 1987 г. больной перенес глубокий термический ожог левого предплечья с последующей кожной пластикой. В августе 1987 г. впервые отметил рецидивирующие макрогематурии, появление которых связывает с переохлаждением. Направлен на обследование.

При объективном исследовании патологических изменений со стороны внутренних органов не отмечено. В общем анализе крови регистрировалось умеренное увеличение СОЭ: Эр 4.27 х 1012/л; Гем 147 г/л; Лейк 6,6 х 109/л; СОЭ 16 мм/ч. Мочевина крови 4,66 ммоль/л; СРВ 0: холестерин 4,68 ммоль/л; / -липопротеиды 4700 мг/л; белок крови 68,3 г/л. Белковые фракции: альбумины 62%; глобулины- «1 4%, «2 5% р 11%,у 18%. Креатинин крови 0,105 ммоль/л, клубочко- вая фильтрация 127 мл/мин, реабсорбция 99,0%. Количественное определение форменных элементов в моче пробой Нечипо- ренко: Лейк 1000/мл; Эр 0; цилиндры 0; суточная протеинурия - следы. Ультразвуковое исследование почек (эхография), цистоскопия патологических изменений не выявили.

Проведенные клинико-лабораторные исследования (лишь умеренное увеличение СОЭ) не позволяли судить о течении какого- либо иммунопатологического процесса в почках. Складывалось впечатление о наличии в анамнезе транзиторной гематурии, обусловленной алиментарными факторами. Однако, иммунологическое исследование по предлагаемому способу выявило, что уровень спонтанной ИГ-секреции в культуре МК, необработанных митС, составил 4700 нг/мл, а в культуре МК, обработанных митС, - 500 нг/мл. Уровень остаточного ИГ-синте- за равен 10,6%. Следовательно, среди лимфоцитов периферической крови пациента присутствуют активированные В-клетки, способные секретировать ИГ без пролиферации, что является характерным признаком иммунопатологического состояния.

При проведенном впоследствии гистологическом исследовании почечного биопта- та был установлен диагноз хронического, мезангиопролиферативного гломерулонеф- рита. Окончательный клинический диагноз; хронический гломерулонефрит, гематуриче- ская форма, мезангиопролиферативный вариант.

Пример 2. В онкологический диспансер была направлена на консультацию амбулаторная больная Л., 33 года, с диагнозом: лимфоаденопатия неясного ге- неза.

Больная предъявляла жалобы на повы- шенную утомляемость и на увеличение шейных лимфоузлов. Две недели назад (начало сентября 1987 г.) почувствовала недомогание: сухой кашель, подъем температуры до 37,4°С, потливость. Участковым терапевтом был поставлен диагноз: острое респираторное заболевание и назначена адекватная терапия. Через 7 дней симптомы воспаления были купированы, однако сохранялась общая слабость и повышенная утомляв- мость. Объективно выявлялись увеличенные (1,5-2,0 см), плотные, безболезненные, подвижные лимфоузлы. В общем анапизе крови: Эр 4,6хЮ1 /л; Гем 146 г/л: Лейк 6,8х109/л; СОЭ 12 мм/ч. Других патологиче- ских симптомов не обнаружено. Для уточнения диагноза больная была направлена на консультацию в онкодиспансер.

Из данных объективного и лабораторного обследований четкого представления о характере заболевания не складывалось. Увеличение лимфоузлов могло отражать реакцию организма на предшествующее воспаление (ОРЗ), могло быть проявлением лимфолейкоза (но нормальный общий ана- лиз крови исключал данное предположение) и, наконец, увеличение лимфоузлов могло быть в результате матастазирования какой- либо злокачественной опухоли. Дифференциальная диагностика вызывала затруднения.

Проведенное иммунологическое обследование по предлагаемому способу показало, что уровень спонтанной секреции ИГ в культурах интактных МК составил 1100 нг/мл, а после обработки из митС 425 нг/мл. Таким образом, уровень остаточной ИГ-секреции равен 38,6%. Следовательно, среди лимфоцитов периферической крови больной Л, присутствуют активированные В-клетки, способные секретировать ИГ без пролифе- рации, что свидетельствует о наличии иммунопатологического состояния, вероятнее

всего, лимфопролиферативного генеза. Проведенная впоследствии биопсия лимфоузла подтвердила данное предположение. Окончательный диагноз: лимфосаркома лимфатических узлов, нодулярная форма.

Пример 3. Больному О., 26 лет, после прохождения профилактического осмотра в поликлинике был выставлен диагноз: хронический тонзиллит, компенсированная форма, гипертрофия миндалин I степени и для исключения различных осложнений (в том числе аутоиммунных) было рекомендовано расширенное лабораторное обследование. Иммунологическое исследование по предлагаемому способу показало, что уровень спонтанной секреции ИГ в культурах интактных МК составил 2520 нг/мл. а в культуре митС-обработанных МК - 45 нг/мл. Уровень остаточного ИГ-синтеза равен 1,8%. Таким образом, при неспецифических воспалительных заболеваниях среди циркулирующих лимфоцитов отсутствуют активированные В- клетки. способные секретировать ИГ без пролиферации, и у данного пациента нет иммунопатологии, ассоциированной с аутоиммунными или лимфопролиферативными заболеваниями

Способ позволяет выявить наличие иммунопатологического состояния при отсутствии достаточных клинико-лабораторных данных и позволяет повысить точность диагностики в среднем на 14%.

Формула изобретения Способ определения иммунопатологического состояния организма, связанного с нарушением В-клеточного звена иммунитета, путем оценки уровня спонтанной секреции иммуноглобулинов в культуре интактных мононуклеаров периферической крови, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, перед культивированием пробу с мононуклеарами обрабатывают митомицином С и при уровне остаточной секреции иммуноглобулине с более 7 % по сравнению с пробой без митомицина определяют наличие иммунопатологического состояния.

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии. Целью изобретения является повышение точности диагностики иммунопатологических состояний, характерных для аутоиммунных и лим- фопролиферативных заболеваний Для достижения цели мононуклеэры периферической крови перед культивированием обрабатывают митомицином С и определяют уровень спонтанной секреции иммуноглобулинов по отношению к контролю При величине остаточного синтеза иммуноглобулинов более 7% судят о наличии иммунопатологического процесса Способ эффективен в 74% случаев и позволяет повысить точность диагностики в среднем на 14% (/ С