Способ индукции супрессорных клеток в периферической крови людей Советский патент 1990 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для оценки иммунного статуса человека в норме и у лиц с патологией имгунной системы.

Целью изобретения является ускорение индукции, повышение супрессорной активности клеток, а также упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Из периферической крови получают мононуклеары в градиенте плотности фиколла-верографина, обрабатывают их кальциевым ионофором А23187 в концентрации 5-10 мкмоль в течение 5-20 мин, отмывают клетки, облучают и определяют супрегеорную активность.

Пример, Кровь из локтевой вены здоровых доноров в объеме 20 мл забирают в стерильные лабораторные пробирг ки с гепарином (15 ед/мл крови). Гепа- ринизированную кровь смешивают со средой 199 в соотношении 1:3 и наслаивают осторожно на градиент плотности фиколл- верографии (плотность смеси 1,076- 1,077). Центрифужные пробирки закрывают стерильной резиновой пробкой и центрифугируют в течение 30 мин при 400g. Собранную интерфазу ( белое облачко) , содержащую мононуклеары, переносят в чистые центрифужные пробирки с помощью пастеровских пипеток, Клет-t ки дважды отмывают в среде 199 при 200g в течение 10 мин, После удаления надосадка клетки ресуспензируют в сресл 1

00

о

СП

00

1Q

де 199 в концентрации и в объеме 5 мл помещают в центрифужные пробирки, В пробирки вносят кальциевый ионо- фор А23187 (Sigma) в концентрации.

10 мкмоль. Предварительно его растворяют в 70° этаноле до концентрации 1 мг/мл и хранят при - 2Q°C. Рабочие разведения А 23187 готовят на среде 199, Концентрация этанола в рабочих разведениях А23187 составляет 0,05%, Пробирки с обработанными ионофором клетками инкубируют 10 мин при при периодическом встряхивании,.посте чего трижды- отмывают в избытке хо- 15 лодной среды 199 центрифугированием в течение 10 мин при 200g. Осадок после последнего центрифугирования ресус- пензируют в среде культивирования (СК) следующего состава: среда RPMI-1640, 20 10% инактивированнойнагреванием феталь- ной сыворотки, 2 мМ глутамина, 4 мМ HEPES-буфера, 20 мкг/мл гентамици- на. Концентрацию клеток доводят до 10б/мл СК, их помещают в пенициллино-25 вые флаконы и облучают в дозе 2000 рад на установке./Стебель За ( , мощность дозы 9,7 Гр/мин), Контролем служат клетки,- подвергшиеся тем же самым воздействием, за исключением обработ- JQ ки ионофором, Вместо ионофора в пробирки добавляют среду 199, содержащую 0,05% этанола, После облучения клетки вносят в плоскодонные 96-луночные микропланшеты в каждую лунку по 100 мкл (10 клеток), В те же лунки вносят равное количество мононуклеаров в том же объеме СК, выделенных от аутологич- ных или аллогенных доноров, а также 10 мкг/мл ФГА в объеме 50 мкл. Каждую пробу ставят в трех параллелях, Куль- тивированье проводят в С02-инкубаторе во влажнби среде, содержащей 5% С02, при 37°С в течение 72 ч. За 6 ч до окончания культивирования в каждую .

3

5

лунку вносят 1 мк Ки 5Н - тимидина в объеме 10 мкл. Клетки осаждают на фильтрах с помощью полуатоматическо- го харвестера. Высушенные фильтры помещают в стеклянные флаконы, содержащие сцинтилляционную жидкость, приготовленную на основе толуола. Активность образцов определяют в счетчике Mark-Ill.

Обработка в течение 10минмонону- клеаров кальциевым ионофором А23187 приводит к индукции клеток, способных резко подавлять РБТ на ФГА: ИС колебался от 70,8 до 93,8%, н среднем 82,1% при исследовании аутологичной РБТ и от 42,4 до 95,7%, в среднем 74,1% при исследовании аллогенных РБТ,

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет значительно ускорить процесс, на 48 ч повысить супрессорную активность клеток - по прототипу супрессорный эффект составляет в аутологической системе 63,9%, а по предлагаемому - 82,1 % в аллогенной системе, соответственно 27,8% и 74,1%,т.е. в среднем ниже на 18,3-46,3%, а также упростить процесс за счет использования ионофора А23187.

Формула изобретения

Спо-соб индукции сунрессорных клеток в периферической крови людей, включающий забор крови, выделение лимфоцитов, инкубацию в присутствии активатора, отмывку, облучение и определение супрессорной активности, отличающийся тем, что, с целью повышения супрессорной активности клеток, ускорения и упрощения способа, в качестве активатора используют ионо- фор А 23187 в дозе 5-10 мкмоль и инкубируют с ним лимфоциты в течение 5- 20 мин.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки иммунного статуса. Цель изобретения - повышение супрессорной активности клеток, ускорение и упрощение способа. У обследуемых берут кровь, выделяют лимфоциты, ресуспендируют их, инкубируют с ионофором А 23187, взятым в концентрации 5 - 10 мкмоль, в течение 5 - 20 мин. Клетки отмывают, облучают и совместно инкубируют с необработанными лимфоцитами и ФГА. Затем по включению 3Н-тимидина определяют супрессорную активность. Супрессорный эффект клеток при действии ионофора А23187 выше на 18,3 - 46,3% по сравнению с прототипом. В результате использования предлагаемого способа сокращается время анализа на 48 ч, упрощается постановка способа в сравнении с прототипом.