Способ определения водорастворимого меланина Советский патент 1991 года по МПК G01N33/52 G01N33/48 

Изобретение относится к методам биохимического анализа, а именно к способам определения концентрации меланиновых природных и синтетических пигментов, и может быть использовано в научно-исследовательской работе и медицине.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Для количественного определения водорастворимого меланина применяют спек- трофотометрические методы обнаружения супероксидного радикала в водной среде. Количество меланина определяют по степени ингибирования реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) в формазан в слабощелочной среде рН 8,2 в присутствии фенаэинметосульфата и восстановленного

никотинамидадениндинуклеотида - НАДН2 или по ускорению реакции автоокисления адреналина в щелочной среде рН 10,2. Количество меланина определяют спектрофотометрически по изменению начальной скорости образования продукта реакций по сравнению с контролем. В первом случае - по торможению начальной скорости образования формаэана (VH) при 560 нм

(VH . t 1 мин), во втором - по

ускорению начальной скорости образования адренохрома (VH) при 500 нм

(,t 1 мин). Концентрацию

меланина рассчитывают по калибровочным кривым.

П р и м е р 1. Определение концентрации меланина с применением метода восстановления нитросинего тетразолия. В

сь

OJ

ел

со ю

спектрофотометрическую кювету толщиной 10 мм, содержащую 50 мкМ нитросинего тетразолия (0,5 мл), 4,5 мкМ феназинмето- сульфата (0,2 мл) ,в 0,05 М пирофосфатном буфере рН 8,2 с 0,69 мкМ ЭДТА. добавляют 0,2 мл водного раствора пробы, содержащей меланиновый пигмент. Непосредственно перед спектрофотометрированием в реакционную смесь добавляют 384 мкМ (1 мл) восстановленного никотинамидадениндинуклеотида - НАДН2. Общий объем реакционной смеси равен 3 мл. Контролем служит проба, не содержащая меланина. Все растворы, кроме буферного, готовят в день анализа и содержат в темной посуде.

Результаты определений меланиновых пигментов, полученных из виноградных выжимок и из выделений тутового шелкопряда, приведены в табл. 1.

Пример 2. Определение концентра- ции меланина применением метода автоокисления адреналина в щелочной среде. В спектрофотометрическую кювету толщиной 10 мм, содержащую 2.3 мл 0,2 М раствора Na-карбонатного буфера рН 10,2, добавля- ют 0,2 пробы и непосредственно перед спектрофотометрированием 0,5 мл 5,4x10 раствора адреналина (гидротартрата) в 0,2 %- ной лимонной кислоте. Количество меланина определяют по величине начальной скорости образования продукта окисления адреналина - адренохрома при 500 нм или

по проценту ускорения реакции по отношению к контрольной, пользуясь калибровочными кривыми.

Результаты определений меланиновых пигментов из виноградных выжимок и из выделений гусениц тутового шелкопряда приведены в табл. 2.

В табл. 3 представлены данные, подтверждающие более высокую точность предлагаемого способа по сравнению с из-, вестным способом.

Таким образом, использование предлагаемого способа обеспечивает повышение точности по сравнению с способом-прототипом.

Формула изобретения Способ определения водорастворимого меланина, включающий обработку пробы и спектрофотометрическую регистрацию, о т- личающийся тем, что, с целью повышения точности способа, пробу добавляют в систему генерации супероксидных радикалов феназинметосульфат-восстановленный и никотинамидадениндинуклеотид в присутствии нитросинего тетразолиевого или адреналин в щелочной среде, а содержание меланина определяют по степени ингибиро- вэния скорости восстановления нитросинего тетразолиевого или по степени увеличения скорости образования адренохрома.

Таблица 1

Таблица 2

Изобретение относится к методам биохимического анализа, в частности к способам определения концентрации меланиновых пигментов. Цель изобретения - повышение точности способа. Количество меланина определяют по степени ингиби- рования реакции восстановления нитроси- него тетразолия в формаэан в слабощелочной среде рН 8,2 в присутствии феназинметосульфата и восстановленного никотинамидадениндинуклеотида - НАДНа, или по ускорению реакции автоокисления адреналина в щелочной среде рН 10,2. Количество меланина определяют спектрофотометрически по изменению начальной скорости образования продукта реакций по сравнению с контролем. (В первом случае - по торможению начальной скорости образования формазана при 560 нм во втором - по ускорению начальной скорости образования адренохрома при 500 нм). 3 табл.

Таблица 3