Способ диагностики хронической внутриутробной гипоксии плода Советский патент 1991 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической перинатологии, и может быть использовано для диагностики хронической внутриутробной гипоксии плода.

Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

У рожениц до родов берут 1 мл крови на исследование активности супероксиддисмутазы (СОД) и ката- лазы. Эритроциты отделяют от плазмы и промывают 3-4 раза изотоническим раствором при повторном центрифугировании в течение 15 мин при 6000 g и 4°С.

Отмытые эритроциты гемолизируют трис-НС1 5 мМ (рН 7,4) в соотношении 1:10. В гемолизате определяют активность СОД и каталазы. Для этого с целью осаждения гемоглобина, который снижает точность в определении активности СОД, к части гемолк- зата добавляют этанол (95°) и хлороформ в соотношении соответственно 1:0,25:0,15.

В процессе перемешивания смеси в течение 15 мин гемоглобин выпадает в осадок, который отделяют путем центрифугирования при 12000 g и 4 С в течение 15 мин. Активность определяют в бесцветной надосадоч- ной жидкости.

Вторую часть гемолизата разводят в 2000 раз бидистиллированной водой и затем определяют активность катала ЗЫ о

Третью часть гемолизата в количестве 0,1 мл используют для определения содержания гемоглобина. Для этого к гемолизату приливают 4,9 мг

о

ел

ND СД

0,024 н. раствора аммиака и степень интенсивности окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 540 нм.

Об активности СОД судят по снижению скорости процесса восстановления нитросинего тетразолия в присутствии НАДНд и феназинметасульфата. Состав инкубационной смеси: 1 мкм I ЕДТА, 1 мг желатины, 0,407 мм нитросинего тетразолия, 1,8 мкм феназинметасульфата и 0,1 мл 1 мМ раствора НАДН2. Общий объем доводится до 3 мл фосфатным буфе- ром 0,07 М (рН 7,8). В контрольной пробе определяют степень восстановления нитросинего тетразолия после инкубации в течение 10 мин при 20- 22°С в темноте и в аэробных условиях. В опытной пробе после добавления в инкубационную смесь 0,04-0,06 мл над- осадочной жидкости определяют в тек же условиях степень снижения процесса восстановления нитросинего тетразолия

Линейная зависимость между объемом добавленной надосадочной жидкости и скоростью ферментативной реакции наблюдалась при торможении процесса восстановления нитросинего тетразолия от 25. до 75%. Измерение степени окраски опытной и крнтрольной проб проводили на спектрофотометре при длине волны 540 нм.

Степень ингибирования определяют по формуле

T ЈsiEo.100в

Т - процент ингибирования процесса восстановления нитросинего тетразолия;

ЕК - оптическая плотность раствора контрольной пробы;

Е - оптическая плотность раствора опытной группы.

Активность СОД выражают в условных единицах 50% ингибирования процесса восстановления нитросинего тетразолия по сравнению с контрольной пробой принято считать одной условной единицей Т

где А - количество условных единиц активности фермента в опытной пробе; Т - процент ингибирования процес- са восстановления нитросинего тетразолия СОД.

5

5

Активность фермента выражают в уловных единицах, отнесенных либо на 1 мг гемоглобина, либо на 1 мл эри- троцитарной суспензии с учетом разведения гемолизата по формулам

v -2U4J.A

V 2 V где А - активность фермента,

усл.ед./мг гемоглобина; А - активность фермента,

усл. ед./мл эритроцитов; V - объем добавленного супер- натанта;

0А02667-А.

А т .™ Е НВ

Е

Мб

- оптическая плотность гемоглобина в растворе гемоли-. зата; 0,14 - постоянный коэффициент раз ведения гемолизата; 0,02667 - постоянный коэффициен

выведенный с учетом разведения гемолизата и постоянного коэффициента экстинции . (190,5) 1 г гемоглобина в кювете 3 см3 при длине волны 540 нм.

Об активности каталазыв гемолиза- те эритроцитов судили по убыли , в тканях за 1 мин при длине волны 230 нм.

Состав инкубационной смеси, мл: Контроль- Опытная ная проба проба

Трис-НС1-ЭДТА- буферный раствор (рН 8,0) 0,05 0,05 Раствор Н402

(10 ммоль)0,90

Вода бидистиллированная 0,93 0,03 Гемолизат в разведении t:2000 0,02 0,02

Снижение оптической плотности в опытной пробе измеряли против контроля каждые 30 с в течение 3 мик при комнатной температуре на СФ-16 (длина волны 230 нм).

Скорость реакции линейная в первые 3-4 мин. При расчете активности каталазы использовали среднее значение изменения оптической плотности пробы за каждую минуту в течение 3 мин;

Е l§orll2±l E2)() ср 3 ,

где Е - начальный показатель отсчета;

E .EI

Е - оптические плотности пробы через 1,2 и 3 мин с начала измерения.

Активность фермента выражали в международных единицах по количеству разрушенного субстрата в ммолях и относили к количеству эритроцитарной взвеси в миллилитрах гемоглобина в граммах:

л Е ер

.--

0,07Г

где А - количество ммоль ., разрушенной в среднем за 1 мин при взаимодействии с 0,02 мл гемолизата; 0,071 - коэффициент молярной экстинкции НгОг.

А . л -2§§гЗ:Е с±:10 А 0%,071 V Eftft где А - активность каталазы, межд.

ед./мл эритроцитарной взвеси; А, - активность каталазы,

межд.ед./г гемоглобина; 268, А10 - коэффициент пересчета ,490, О 077 склаДьша1°Щиися

из учета разведения эритро- цитов, молярного коэффициента экстинкцин (190,5) 1 г гемоглобина в кювете 3 смэ при длине волны 540 нм и коэффициенте молярной экстинкцни (0,071).

При одновременном снижении активности СОД и каталазы в эритроцитах крови матери диагностируют хроническую внутриутробную гипоксию плода (уровень активности ферментов СОД и каталазы в эритроцитах у здоровых беременных соответственно 1,78 усл.ед./мг гемоглобина и 19,14д Ц104 межд.ед./г гемоглобина.

Пример 1. Мать В. и ее новорожденный. У матери по данным анамнеза с 30 недель беременности развился поздний токсикоз. Скорость перекис- ного окисления липидов (по уровню диенкетонов и конъюгированных диенов) в эритроцитах не превышала величин в контрольной группе женщин. Активность СОД и каталазы была снижена (0,92 усл.ед./мг гемоглобина и 13,1А, XlO межд.ед./г гемоглобина соответственно) . Несмотря на нормальные вели- ,чины перекисного окисления липидов

(ПОЛ) у матери своевременно диагностировали внутриутробную хроническую гипоксию плода по обнаруженному снижению активности ферментов. Последующие наблюдения подтвердили диагноз гипоксии плопа. Новорожденный ребенок родился в состоянии асфиксии с оценкой по шкале Апгар 6/8 (патологии

родового акта не отмечено). Активность ферментов в пуповинной крови также низкая - 0,93 усл.ед./мг гемоглобина для СОД и 7,00.10 межд.ед./г гемоглобина для каталаяы. В первые

5 дни состояние ребенка средней тяжести, к груди приложен на 4 день, отмечалась типичная патологическая неврологическая симптоматика, возникающая у детей, перенесших длительную внутрнутробную гикопсию.

Таким образом, нормальные показатели ПОЛ в этом случае не позволили установить диагноз внутриутробной хронической гипоксии плода. Изменения ак5 тивности СОД и каталазы эритроцитов точно отражали состояние плода и новорожденного.

Пример 2. Мать К. и ее новорожденный. Из анамнеза известно, что

0 беременность у матери протекала благоприятно. В родах развилась первичная слабость родовой деятельности, проводилась родостимуляция. В эритроцитах матери выявлено повышение скорости

5 ПОЛ, при этом величина активности СОД 1,79 усл. ед./мг гемоглобина и величина активности каталазы 21,0 МО межд.ед./г гемоглобина соответствовали нормальным показателям. Ребе0 нок родился в удовлетворительном состоянии, с оценкой по шкале Апгар 9/10 в первые сутки приложен к груди. При дальнейшем наблюдении состояние оставалось вполне удовлетворительным,

5 и на 6 день жизни он выписан из родильного дома домой. Активность СОД и каталазы в пуповинной крови не отличались от контрольной группы (1,28 усл. ед./мг гемоглобина и 12,0

0 хЮ4 межд.ед./г гемоглобина, соответственно) . Нормальный уровень активности антиокислительных ферментов характеризовал удовлетворительное состояние плода и новорожденного, в то

5 время, как ускорение процессов ПОЛ не отражало истинного его состояния.

Применение способа в медицинской практике позволит сократить время ди716512158

агностики в 2 раза и диагностировать щ и и с я тем, что, с целью ускоре- хроническую внутриутробную гипоксию ния и повышения точности способа, в плода с точностью до 957,.эритроцитах крови рожениц определяют

Формула изобретения с содержание супероксиддисмутазы и каталазы и при одновременном снижении

Способ диагностики хронической этих показателей относительно нормы внутриутробной гипоксии плода путем диагностируют хроническую внутриутроб- исследования крови, отличаю- Ную гипоксию плода.

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической пери- патологии, и может быть использовано для диагностики внутриутробной гипоксии плода. С целью повышения точности и ускорения способа определяют значения активности супероксиддисмутазы в эритроцитах рожениц до наступления родов, рассчитывают их на 1 мг к 1 г гемоглобина соответственно и при одновременном снижении этих показателей относительно нормы диагностируют хроническую внутриутробную гипоксию плода. Применение способа позволит сократить время постановки диагноза в 2 раза и повысить точность определения до 95%.