Способ определения супероксидных анион-радикалов Советский патент 1987 года по МПК G01N21/27 G01N33/48 

Изобретение относится к биологи- ческой химии и может быть использовано в биохимии и медицине для определения генерации супероксидных радикалов химическими и биологическими системами.

Цель предложения - упрощение способа достигается за счет использования в качестве специфического перехватчика супероксидных анионов эквимолярной смеси карнозина (/з-ала- нил-о/ -гистидина) и ионов двухвалентной меди в конечной концентращ1и 1-10 мМ. С целью повышения специфической активности перехватчика в смесь дополнительно вводят ионы двухвалентного цинка в эквимолярном соотношении.

Пример 1. Определение специфической супероксидперехватывающей активности карнозина в присутствии ионов двухвалентной меди и двухвалентного цинка.

Определение проводили в двух системах, генерирующих супероксидные радикалы.

Система 1. В кювет спектофотометр

В табл. 1 представлена зависимо степени ингибирования восстановлен нитросинего тетразолия (эта зависи

и CuS04.

Таблица

35

40

вносили 1,7 мл 100 мМ фосфатного буфера, рН 8,3, 0,2 мл НАДН (0,7 мг/мл),30 мость не различалась в системах 0,3 мл феназинметасульфата (2,3 мг/мл) I и II) от концентрации карнозина .и 1 МП нитросинего тетразолиевого (4,8 мг/мл). Записывали изменение оптической плотности при 560 нм на спектрофотометре в течение 1,5 мин. Возрастание оптической плотности, характеризующее скорость восстановления красителя, происходило линейно. На основании этой скорости определяют скорость .генерации супероксидных анион-радикалов. В качестве красителя можно также использовать феррицито- хром с регистрацией оптической плотности при 550 нм.

Система II. В кювету спектрофотометра вносили 0,2 мл ксантина (2 мг/мп), 2,7 мл натрий-карбонатного буфера, 75 jM, рН 10,2, содержащего 1,5х10- М ЭДТА, 0,2 МП раствора ксан- тйноксидазы и 0,2 мл нитросинего 50 тетразолия (18 мг/мл). Возрастание оптической плотности при 560 нм происходило линейно в, течение 1,5-2 мин В качестве красителя можно использо45

Из табл. 1 видно, что карнозин 55 присутствии CuSO в зависимости о концентрации осуществляет перехва супероксидных радикалов, ингибиру восстановление красителя. Специфи ность перехвата подтверждена отсу

вать ферроцитохром с регистрацией оптической плотности при 550 нм.

Для подтверждения генерации этими системами именно супероксидных радикалов в кюветы добавляли супероксиддисмутазу в различных разведениях, подбирая разведения таким образом, чтобы в пробе присутствовала 1 ед. активности фермента, т.е. то количество фермента, которое тормозит восстановления красителя в 2 раза. Рассчитать исходно это количество фермента исходя из концентрации белка невозможно в связи с различной удельной активностью разных препаратов супероксидд смутазы и изменением удельной активности в процессе хранения.

Готовили 100 мМ раствор карнозина, -содержащий 100 мМ CuSO, а также 100 мМ раствор карнозина, содержащий 100 мМ CuSO и 100 мМ ZnSO. Проводили определение скорости генерации

супероксидных анион-радикалов с использованием систем I и II. Концентрация ингредиентов сист емы подобраны таким образом, чтобы скорость восстановления в отсутствие перехватчика

составляла 0,1 ед. оптической плотности 10 с в обеих системах.В табл. 1 представлена зависимость степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия (эта зависимость не различалась в системах I и II) от концентрации карнозина

и CuS04.

Таблица 1

мость не различалась в системах I и II) от концентрации карнозина

Из табл. 1 видно, что карнозин в присутствии CuSO в зависимости от концентрации осуществляет перехват супероксидных радикалов, ингибируя восстановление красителя. Специфичность перехвата подтверждена отсутствием взаимодействия с другими радикалами кислорода (перекисью водорода в системе окисления скополетина, гидроксильными радикалами), Использование концентраций перехватчика ниже 1 NM нецелесообразно, поскольку степень ингибирования незначительна. В связи с тем, что ошибка измерения сильно возрастает при превьшении степени ингибирования 70%, нецелесооб- разно также использовать концентрации вьше 10 ,

В табл. 2 представлена зависимость степени ингибирования от концентрации карнозина в присутствии CuSO и ZnSO

Таблица 2

35

42

50

68

72

90

100

Из табл. 2 видно, что дополнительное введение в смесь ZnSO приводит к существенному повьшёнию специфической активности перехватчика, что дает возможность использовать его в значительно более низких концентрациях (ингибирование на 50% в отсутствие ZnSO достигается при концентрации карнозина и CuSO 7,5 мМ, а в присутствии ZnSO при концентрации 1,0 мМ), Перехватывающая активность карнозина в присутствии Zn без Си значительно ниже активности карнозина в присутствии Си, Следует также отметить, что введение в системы Си или Zn без карнозина в концентрации до 15 NM вызывало снижение скорости

5

5

восстановления красителя. Супероксид- перехватывающей активностью обладают комплексы карнозина с медью или медью-цинком (известно, что с этими металлами карнозин образует прочные комплексы)./

Степень ингибирования, представленная в табл. 1 и 2 не зависит от ис- пользованного препарата карнозина и соли меди или цинка (сходные данные получены при использовании солянокислых солей меди и цинка; важно, чтобы соль бьта хорошо растворима, а анион ббш нейтральным - не взаимодействовал с системой генерации суперокси- да) .

Таким образом, использование в качестве перехватчика супероксидных радикалов карнозина в присутствии ионов двухвалентной меди или цинка вместо супероксиддисмутазы позв оляет упростить способ определения супероксидных радикалов за счет отсутствия необходимости подбора концентрации перехватчика в каждой серии экспериментов, а также использования стабиль- ных растворов перехватчика с неизменной специфической активностью.

Пример 2. Определение суперг оксидных анион-радикалов в биологических объектах.

А. Определение генерации супероксидных радикалов лейкоцитами.

Из крови крыс дифференциальным центрифугированием получают фракцию лейкоцитов, суспендируют в среде Хенкса и в разных разведениях вносят в кювету спектрофотометра, содержащую среду Хенкса и нитросиний тетразолий, подбирая такое разведение клеток, чтобы скорость нардстания оптической плотности при 560 нм была линейна. по крайней мере в течение 1,5- 2 мин, а скорость прироста оптической плотности составляла 0,1tO,03 ед. оптической плотности 10 с. В пробы с подобранной концентрацией клеток вносят различные концентрации карнозина в присутствии ионов меди или меди+цинка и определяют ингибирование скорости генерации,радикалов. Для сравнения вносят супероксиддис- мутазу, концентрацию которой пред- g варительно подбирают в одной из моде льнмх систем генерации супероксидных радикалов (см. пример.1, системы I и II). Полученные данные представлены в табл. 3.

0

5

0

5

0

Cu-карнозин, 7,5 мМ

Си-карнозин, 10 мМ

Си, Zn KapHo3HH, 1 мМ

Си, Zn-карнозин, 10 мМ

СОД, 1 ед

СОД, 2 ед

СОД,. 10 ед

Из данных табл. 3 видно, что большая часть радикалов, восстанавливающих нитросиний тетразолий, является супероксидными радикалами, так как на 80%-ное восстановление ингиби- руется супероксидцисмутазой (СОД). Видно также, что использование в качестве перехватчика карнозина в присутствии меди или цинка не уступает прототипу по специфичности,

Б. Определение супероксидных анион-радикалов в спинно-мозговой жидкости.

Определение проводили в пробах спинно-мозговой жидкости кролика (1) и человека (2), взятых при помощи пункции. Подбирали разведение проб таким образом, чтобы скорость восстановления нитросинего бьша оптимальна (см. пример А) и на оптимальной концентрации спинномозговой жидкости в кювете спектрофотометра регистрировали скорость изменения оптической плотности в присутствии перехватчиков (табл, 4),

Из данных табл. 4 видно, что в пробе 1 - 70%, а в пробе 2 - 60% скорости восстановления нитросинего тетразолия ингибируется специфическими перехватчиками, значит именно эта часть приходится на долю генерации супероксидных анион-радикалов.

Cu-карнозин, 7,5 мМ Cu-карнозин, 10 мМ

0% 30% 65%

Си, Zn-карнозин,. 1 мМ 30%

0% 25% 50% 25%

2Q Си, Zn-карнозин,10 мМ 70%60%

СОД, 1 .ед.30%27%

СОД, 10 ед.70%60% 25

Примеры показывают, что замена супероксиддисмутазы на карнозин 30 в присутствии ионов меди и цинка

не приводит к снижению специфичности точности и чувствительности способа, обеспечивая при этом его упрощение,

35 Формула изобретения1,Способ определения супероксидных анион-радикалов путем добавления в систему генерации радикалов краси40 теля и реагента, обладающего свойст вом связывать супероксид-радикалы, с последующей инкубацией, спектро- фотометрией и определением результат по величине снижения скорости вос45 становления красителя, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве реагента используют эквимолярную смесь карнозина и ионов двухвалентной меди

50-в конечной концентрации 1-10 гЛ1.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью повышения активности реагента, в.смесь

55 дополнительно вводят ионы двухвалентного цинка при эквимолярном соотношении корнозина, ионов цинка и ионов меди.

Изобретение относится к области . биохимии. Для упрощения способа добавляют в систему генерации радикалов краситель и эквимолярную смесь карнозина и ионов двухвалентной меди в конечной концентрации 1-10 мМ с последунщей инкубацией, спектрофо- тометрией и определением результата по величине снижения скорости восстановления красителя. Для повьшения специфической активности реагента, связьтающего супероксидрадикалы, в смесь дополнительно вводят ионы двухвалентного цинка в эквимолярном соотношении, 1 з.п, ф-лы, 4 табл. i (/) ел to оо ГС vl