Способ определения активности нейротоксической эстеразы Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для выявления раннего (доклинического) проявления замедленного нейро- токсического действия фосфорорганических соединений.

Цель изобретения - упрощение способа определения активности фермента.

П р и м е р. Для получения лейко- взвеси и осаждения эритроцитов в центрифужную пробирку с каплей гепарина вносят 5 мл крови, добавляют 0,2 мл 10%-ной желатины и помещают на 30-35 мин в термостат при 37 С, отсасывают надосадочный слой в пробирку и отмывают дважды лейковзвесь центрифугированием с трис-буфером с ЭДТА (рН 3,0 при 1000 об/мин в течение 10 мин).

В выделенной лейковзвеси количество клеток составляет 8-10 млн. в

1 мл. Полученную взвесь гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе,добавляя 1,5-2,0 мл буфера трис-НС1 в ЭДТА.

Активность нейротоксической эстеразы (НТЭ) в белой крови определяют следующим образом: к парным пробам, содержащим по 0,5 мл гомогената лей-( ковзвеси, добавляют - в первую: 0,25 мл раствора параоксона и 0,25 мл 102 М-раствора мипафокса; во вторую: 0,25 мл М раствора параоксона и 0,25 мл буфера без мипа- фокса. Обе пробы инкубируют в течение 30 мин при 37°С, а затем добавляют по 1 мл субстратного раствора, содержащего по 0,5 мг/мл фенилвале- рата, и продолжают инкубацию в течение 45-60 мин. После этого реакцию останавливают добавлением 1%-ного раствора додецилсульфата натрия в буфере, содержащем 0,25 ммоль 4-ами054

О СЭ СЛ

ноантипирина. Для появления окраски во все пробы добавляют по 0,5 мл 0,4%-ного водного раствора КэКе(СН)б. Через 15 мин пробы колориметрируют на двухлучевом спектрофотометре СФ-13 (длина волны 510 нм, кювета 1 см). Контролем служит проба,содержащая оба инкубатора - параоксон и мипафокс.

Активность фермента (нмоль/мин-кг) белка рассчитывают по формуле

1000 1,39Гь.с

де

за

АЕ - разность экстинций

1 мин; 1,39 -коэффициент молярной

экстинций, Фенола; b - количество белка, мг в

1 мл пробы;

1000 - коэффициент перевода активности в нмоль; с - оптический путь луча в спектрофотометрической кювете, см.

Для стандартизации полученных езультатов определяли белок.

Q

5

0

5

В таблице приведены данные активности нейротоксической экстеразы (нМ/мин мг белка) в лимфоцитах х с примесью тромбоцитов и моноцитов, гранулоцитах и всей популяции белой крови Х + sx, п-10

В эксперименте при введении курам и крысам афоса в дозах, вызывающих ингибирование экстеразы,наблюдалось однонаправленное изменение активности фермента как в лимфоцитах периферической крови, так и во всей лей- ковзвеси, что позволяет использовать определение активности во всей лейковзвеси для прогнозирования замедленного нейтротоксического действия фосфорорганических соединений. Формула изобретения

Способ определения активности нейротоксической эстеразы крови путем спектрофотометрического измерения продукта гидролиза фенилвалерата, отличающийся тем,что, с целью упрощения способа, определение активности фермента проводят во всей лейкоцитарной взвеси.

Изобретение относится к способу определения активности нейроток- сической эстеразы, может быть использовано для выявления доклинического проявления замедленного нейтротокси- ческого действия фосфорорганических соединений. Цель изобретения - упрощение способа определения активности фермента нейротоксической эстеразы в периферической крови человека.Это достигается тем, что активность фермента определяют не только в лимфо- щитах и тромбоцитах, как это было известно ранее, но и во всей лейкоцитарной взвеси (гранулоциты).

18,2+2,8 19,8+0,9, 78 85