Способ определения активности интерлейкина 2 Советский патент 1991 года по МПК G01N33/60 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для определения актинвости интерлей- кина 2 в плазме крови здоровых людей и онкологических больных после гор- моно и химиотерапии, а также в исследовательской практике для определения наличия интерлейкина 2 в оцениваемых образцах.

Цель изобретения - упрощение способа при одновременном повышении чувствительности.

Способ осуществляется следующим образом.

Выделяют лимфоциты из периферической крови (ЛПК) человека, суспендируют их в стандартной среде для культивирования лимфоцитов в концентрации 1-540е клеток в 1 мл. В лунки 96 луночных стандартных плоскодонных пластин вносят клеточную суспензию .ЛПК. К части проб добавляют фитоге- магглютинин (ФГА), дексаметазон (ДМ),

исследуемые образцы с интерлейки- ном 2.

Клетки инкубируют в течение 72 ч при 37°С и 5% С02 за 6 ч до окончания 5 инкубации во все лунки добавляют по 1 мкКю радиоактивного предшественника. Клетки собирают на фильтры, высушивают, просчитывают радиоактивную метку.

(/

Наличие интерлейкина 2 в препарате определяют следующим образом.

За 100% принимают значение срт- количество импульсов в 1 мин, которое дают РГА - стимулированные димфоци- ты. Процент опыта подсчитывают относительно значения ерш ФГА - стимулированных лимфоцитов. Активным считают тот препарат интерлейкина 2, который усиливает пролиферацию по сравнению с лимфоцитами, обработанными гормоном, подавляющим пролиферацию ФГА - стимулированных ЛПК0

со

05

Для теста необходимо 3-15 мкл следуемого образца.

Пример Из периферической крови человека выделяют лимфоциты и суспендируют-их в среде RPMI - 1640, содержащей 10% ТЭС, 2 -M. L-глюта- мина, 10 мМ HEPES и 100 ед. пеницилг лина и 100 мкг стрептомицина на 1мл среды концентрации 1-5«106 клеток в 1 мл„

В каждую лунку 96-луночных плоскодонных пластин вносят по 200 мкл подготовленной клеточной суспензии.

ДМ ( S-IO M Sigma) разводят 96%-ным этанолом, конечная концентрация 10 М. ФГА используют в стандартной концентрации, применяемой для реакции бластотрансформации лимфоцитов .

В определенной последовательности (ФГА, итерлейкин 2, ДМ или спирт) добавляют реагенты в необходимые лунки по схеме;

клетки + 2 мкл этанола;

клетки + 2 мкл ДМ;

клетки + 2 мкл ФГА;

клетки + 2 мкл ФГА + 2 мкл ДМ;

клетки + 1-5 мкл образца;

клетки + 2 мкл ГА + 1-5 мкл образца;

клетки + 2 мкл ФГА .+ 1-5 мкл образца + 2 мкл ДМ.

Тестирование проводят в 2-3 п$ раллельных пробах.

Клетки инкубируют в течение 72 ч при и 5% С02. За 6 ч до окончан инкубации в каждую лунку добавляют 1 мкКю метил-3Н-тимидина. Клетки собирают на фильтры из стекловолокна типа GF-C с помощью прибора для полуавтоматического сбора клеток (Cell Harvester, Flow).

Фильтры высушивают и помещают во флаконы, содержащие 5 мл сцинтшшя- ционной жидкости (4,0 г РРО и 0,2 г, РОРОР в 1 л толуола) Радиометрию образцов проводят в жидкостном сцин- тилляционном Рг-счетчике, определяя количество импульсов в 1 мин (срт).

Результаты опыта представлены в табл. 1-3.

По данным табл. 1 и 2 можно пострить калибровочный график (табл„ 4). Тогда количество интерлейкина 2 в пр

парате можно выразить в единицах ак тивности. Так препарат 1, повышающий {пролиферацию ФГА - стимулированных (лимфоцитов, обработанных ДМ, до 69%

-

.Q

, 20

25

5 ия

50

ое40

55

имеет активность 350 ед. Препарат 2, повышающий пролиферацию ФГА - стимулированных лимфоцитов, обработанных ДМ, до 83% имеет активность 600 ед.

Все остальные варианты опытов, указанные в табл. 1-4, являются контрольными. Вариант 1 (клетки + этанол) показывает пролиферацию клеток в условиях опыта (дексаметазон растворен в этаноле). Вариант 2 показывает действие гормона на нестимулированные лимфоциты. Вариант 4 (клетки + ФФГА + ДМ) показывает действие гормона на ФГА - стимулированные лимфоциты (28,5, 28 и 36% - подавление пролиферации).

По отношению к варианту 4 рассматривается действие исследуемого образца: в случае активного препарата процент опыта должен быть выше контрольного варианта 4 (51 против 28,5% в табл. 1, 94 и 97% против 28% в табл. 2, 69 и 83% против 36% в таблице 3).

Варианты 5 и 6 (также контрольные) показывают действие исследуемого образца на нестимулированные и ФГА на стимулированные лимфоциты.

В табл. 5 приводятся результаты типичного опыта по тестированию на активность интерлейкина 2 в плазме онкологического больного. Плазма получена при плазмофорезе, и центри- фугирована при 2000 об/мин в течение 30 мин при .

Таким образом, усиление пролиферации клеток образцом по сравнению с ФГА стимулированными лимфоцитами, обработанными гормонами, свидетельствует о наличии в образце плазмы крови активного интерлейкина 2.

Для анализа пробы известным способом необходимо внесение достаточно большого количества образца (100- 300 мкл), для анализа пробы предлагаемым способом требуется не более 15 мкл исследуемого препарата, чувствительность при этом возрастает на порядок.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность и упростить способ определения активности интерлейкина 2 за счет исключения культуры клеток CTLL (по известному способу). Формула изобретения

Способ определения активности интерлейкина 2, включающий культивирование клеток, вьщеление контрольного и опытного образцов, добавление в опытный образец пробы с интерлейки-) ном, внесение в оба образца метил- Н- тимидина, определения содержания ин- терлейкина 2 по уровню радиоактивности в опытном образце в сравнении с контрольным, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа при одновременном повышении чувствительности, в качестве клеток используют свежевыделенные лимфоциты периферической крови человека, стимулированные фитогемагглютинином, а в опытный образец, содержащий интер- лейкин, дополнительно вносят декса- метазон в концентрации 10 М.

5 разец + ДМ

196392+984

соответствует 100%, соответствует 28,5%. соответствует 51%.

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для определения активности ин- терлейкина 2 в плазме крови человека и других биообъектах Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа. Цель достигается за счет использования лимфоцитов клеток периферической крови человека, стимулированных фитогемаг- глютинином в качестве клеток тест- системы, и дополнительного внесения в систему дексаметазона в концентрации 10 М. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности способа на порядок. 5 табл.

соответствует 100%0 соответствует 28% „ соответствует 94%„ соответствует 97%„

I Таблица 3

Таблица 2

Клетки + ФГА + образец:

препарат 1 препарат 2

Клетки + ФГА + раэец:

препарат 1 препарат 2 + ДМ

Значениесоответствует 100%.

3начениесоответствует 30%,,

3начениесоответствует 69%.

3начениесоответствует 83%„

Таблица 4

Активность интерлей кина 2, ед. актив- ностй стандартного препарата

300 350 600 1000

Продолжение табл.3

170656 39380 131863 26238

115718±20990 139642 7893

Таблица5

..20