Рекомбинантная плазмидная ДНК @ - @ 2-19, кодирующая синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструирования @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека Советский патент 1992 года по МПК C12N15/26 C12N1/21 

ации репликации (Ori) (ColEI-репликон), ген температурочувствительного реп рессора cits 857 фага А, ген устойчивости к ампи- циллину (Арг), тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага fd (tfd). регулярную область PROR . SD-последова- тельность (SDcro) и ATG-инициирующий ко- дон (f-Met) гена его фага Я, кодирующую последовательность зрелого интерлейкина- 2 человека; соединение регуляторной обла- сти PROR и ATG-кодона ; f-Met гена его с последовательностью гена IL2 и терминаторами транскрипции fd (tfd) осуществлено так, что образован гибридный участок связывания рибосом, имеющий следующую нуклеотидную последовательность 5 - ...TAAGGAGGTTGTATGGCC...-3 . где TAAGGAGGT и ATG-SD-последовательность и инициирующий кодом гена его соответственно, GCC - первый (Ala) кодон интерлей- кина-2, а за терминирующим кодоном гена IL2 расположен тандем р-независимых терминаторов транскрипции fd (tfd); имеет уникальные участки узнавания рестриктаз Clal, координата которого является началом отсчета (0) на чертеже, Xbal ( 990), BgtH (1250), Pst( 3070).

Способ конструирования рекомбинант- ной плазмиды pPR-IL2-19 заключается в том, что в состав плазмиды рАА1213-23 вво- дят с помощью олигонуклеотидного линкера уникальный участок расщепления для стриктазы Bgfll в З1 -нетранслируемую |Сть гена IL2, затем полученную таким образом плазмиду рАА1213-23В обрабатыва- ют рестриктазой Cfr 13 и достраивают образующиеся однонитевые концы молекул ДНК Кленовским фрагментом ДНК-поли- меразы I Е.соП, после чего фрагмент с геном интерлейкина интегрируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в состав векторной молекулы pPR 1 24В, расщепленной рестриктазой BamHI и с удаленными 51-эндонуклеазой однонитевыми концами ДНК, затем препарат обрабатывают рестриктазой Bgfll и обеспечивают циклизацию линейных молекул ДНК ДНК-лигазой Т4. полученной смесью трансформируют клетки E.coli C600, трансформанты высевают на среду с ампи- циллином и культивируют при 28°С с после- дующей селекцией на пониженную скорость роста при 42°С. Из отобранных таким образом клонов выделяют плазмид- ную ДНК, обозначенную как pPR-IL2-19, в которой точность воссоединения фрагмен- тов проверяют восстановлением на стыке исходных участков ДНК ранее отсутствующей последовательности узнавания ре- стриктазы BspRI.

Выбор метода селекции рекомбинант- ных клонов основывается на известных данных о возможном токсическом действии некоторых белков эукариотического происхождения при их суперпродукции в бактериальных клетках в условиях дерепрессии промотора, регулирующего транскрипцию чужеродного гена.

Штамм E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IL2-19) (регистрационный номер ВКПМ В-3866 во Всесоюзной коллекции примышленных микроорганизмов) - продуцент ин- терлейкина-2 человека.

Штамм получают трансформацией ре- ципиентного штамма E.coli ВНИИгенетика VL903 рекомбинантной плазмидой pPR-IL2- 19 с последующим отбором рекомбинант- ных клонов на среде с ампициллином при 28°С и определением активности интерлей- кина-2. Активность определяют стандартными методами по поддержанию роста интерлей- кин-2-зависимолкультуры CTL2 цитотоксиче- ских лимфоцитов мыши. В качестве стандарта используют природный интерлейкин-2 человека с активностью 11 международных ед. на 1 мл в экстрактах клеток трансформантов после дерепрессии рк промотора, достигаемой культивированием штамма в течение 1-2 ч при 42°С. В качестве реципиента могут быть также использованы штаммы E.coli СбОО, НВ101, TGI, VL902 и другие производные E.coli K12.

Штамм E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IL2-19) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки; клетки прямые, палочковидные, слабоподвижные, способны к образованию нитевидных форм, грамотрицательные, неспоронорные, размер отдельных клеток 3-5 мкм.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на плотных и жидких простых синтетических, полусинтетических и комплексных средах. При росте на агаризозан- ном бульоне Хоттингера или 1 -бульоне образуют гладкие, круглые, слабоматовые ослизненные колонии. При выращивании в жидких средах типа L бупьона или М9 с ка- заминовыми кислотами образуют разно- мерную взвесь.

Ф из полого-биохимические признаки. Клетки способны к росту в диапазоне 5- 40°С (оптимум 37°С) при рН 6,7-7,5. В качестве источника углерода используют углеводы (например, сахарозу) и аминокислоты. Обладают ауксотрофностью по метио- нину. Источником азота могут служить минеральные соли в аммонийной форме, а также органические соединения в виде пептона, тритона, дрожжевого экстракта и аминокислот.

Устойчивость к антибиотикам. Штамм устойчив к ампициллину в концентрации до 100 мг/л при выращивании в жидких и на агаризованных питательных средах.

Стабильность плазмиды. При хранении клеток на агаризованной среде, при серии последовательных пересевов и в процессе глубинного культивирования в жидкой среде с антибиотиком не происходят потери и перестройки плазмиды,

П р и м е р 1. Конструирование рекомби- нантной плазмиды pPR-IL2-19.

Получение целевой плазмиды, обеспечивающей синтез интерлейкина-2 человека, проводят в несколько этапов, заключающихся в создании промежуточной плазмиды рАА1213-23В и последующего конструирования рекомбинантной плазмиды pPR-IL2-19.

3 мкг ДНК плазмиды рАА 1213-23 расщепляют в-10 ед. рестриктазы Stul в пробе объема 30 мкл, содержащей буфер для рестрикции- (10 мМ трис-HCi рН 7,9, 6 мМ MgCl2, 6 мМ 2-меркаптоэтанол, 150 мМ NaCI), далее ДНК осаждают из реакционной смеси добавлением этанола. Осадок отделяют центрифугированием в 20 мкл Н20. Воссоединение линеаризованной плазмидной ДНК с Bgfll-линкерами Collaborative Research проводят с помощью 20 ед. ДНК- лигазы Т4 в пробе объемом 30 мкл, содержащей буфер для лигирования (60 мМ трис-HCI, рН 7,6. 10 мМ MgCl2, Ю мМ 2- меркаптоэтанол, 0.4 мМ (АТФ), 2 мкг плазмидной ДНК и 0,5 мкг линкеров.

После лигирования ДНК из реакционной смеси осаждают этанолом, растворяют и подвергают ферментативному гидролизу рестриктазой Bglll в пробе объемом 40 мкл. содержащей буфер для рестрикции-2 (6 мМ трис-HCI, рН 7,6, 6 мМ MgCl2. 6 мМ 2-меркаптоэтанол, 50 мМ NaCI). ДНК вновь осаждают этанолом, растворяют и обеспечивают циклизацию молекул ДНК. для чего 1 мкг препарата плазмидной ДНК в 240 мкл буфера для лигирования обрабатывают 2 ед. ДНК-лигазы Т4. Полученной смесью трансформируют клетки E.coli C600. Эффектив; ность трансформации составляет до 5 -10° колоний на 1 мкг нативной плазмиды рАА1213-23. Отбирают клоны, устойчивые к ампициллину (100 мкг/мл). из них выделяют плазмидную ДНК по модифицированному методу Бирнбойма и Доли, используют ее для рестрикционного анализа. Полученная таким образом плазмида рАА1213-23В в отличие от исходной рекомбинантной молекулы рАА1213-23 содержит

уникальный участок расщепления Bglll вместо имевшейся последователь .с 1 /знаьз ния Stul.

30 мкг ДНК плазм иды рАА 12 i l -2 JB рзсщепляют рестриктазой Cfr 13 ..0° ед активности) в пробе объемом 1 мкл содержащей буфер для рестр - ,:.ч, 1 Продукты ферментативного гидролиза п&деер- гают электрофорезу в 1,1%-ном геле

0 легкоплавкой агарозы в трис-ацетатной буферной системе при напряженности поля 5 В/см. Зону геля, содержащую фрагмент ДНК длиной «750 п.н., вырезает и приводят элюцию ДНК. Для достройки одноцепо5 чечных концов ДНК с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I F со, выделенный из геля фрагмент обрабатывают в пробе объемом 20 мкл, соде ржа .чей 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 10 мМ MgCi2. по 30 мкМ

0 дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Реакцию останавливают прогреванием. ДНК из смеси переосаждают этанолом и растворяют в 20 мкл.

Полученный препарат фрагмента плаз5 миды рАА1213-23В используют на дальнейших этапах конструирования для интеграции кодирующей части интерлейкина-2 человека в векторную плазмиду PBR124B.

03 мкг ДНК плазмиды pBR124B расщепляют рестриктазой BamHI в пробе объеме.и 12 мкл, содержащей буфер для рестрикцми- I. Реакцию останавливают фенольной де- протеинизацией ДНК и переосаждением

5 нуклеиновой кислоты этанолом. Осадок растворяют в 20 мкл Н20. Удаление образующихся при расщеплении ДНК рестриктазой одноцепочечных концов осуществляют при помощи 51-эндонуклеазы. Для этого ДНК

0 гидролизуют 30 ед. 51-эндонуклеазы в пробе объемом 50 мкл. содержащей 30 мМ СНзСОО№, рН 4,4. 4,5 мМ ZnSO-1. 250 мМ NaCI в течение 20 мин при 20°С Реакцию останавливают обработкой фенолом и ДНК

5 переосаждают этанолом. Осадок растворяют в 15 мкл Н20.

Полученный таким способом препарат линеаризованной плазмиды pBR124B воссоединяют с фрагментом плазмиды

0 рАА1213-23В, выделение которого указано Для этого 1 мкг плазмидной ДНК и 2 мкг фрагмента обрабатывают ДНК-лигазой фаза Т4 в буфере для лигирования при обьеме реакционной смеси 30 мкл. После пере5 осаждения ДНК и растворения осадка в 20 мкл Н20 препарат обрабатывают ре- стриктэзой Bgfll указанным образом. ДНК еще раз осаждают этанолом. растворяют и обеспечивают воссоединение линейных молекул ДНК в кольцевые формы с помощью

ДНК-лигэзы Т4 при обработке препарата ферментом в объеме реакционной смеси 300 мкл. Полученный препарат используют для трансформации клеток E.coli C600 с последующей селекцией трансформантов на среде с ампициллином при культивировании клеток в течение суток при 28°С. Среди полученных трансформантов отбирают варианты, обладающие пониженной способностью к росту при 42°С. Из указанных клонов выделяют плазмидную ДНК и подвергают рестрикционному анализу. В полученной плазмиде pPR-IL2-19 на стыке соединяемых участков ДНК, кодирующих первый кодом гена его фага А и Ala-кодон интерлейкина-2 человека, образуется участок расщепления рестрикционной эндо- нуклеазы BspR,

П р и м е р 2. Получение штамма E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IL2-19j - проду- цента интерлейкина-2 человека.

Плазмиду pPR-IL2-19. кодирующую синтез интерлейкина-2 человека, трансформацией (пример 1) вводят в клетки штамма реципиентного E.coli ВНИИгенетика VL 903 из коллекции ВНИИгенетики (регистрационный номер ВКПМ В-3546 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов). Эффективность трансформации клеток Е.coli ВНИИгенетика VL 903 составляет около 10 клонов на 1 мкг нативной плазмиды pPR- IL2-19. Трансформанты отбирают на среде, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) после культивирования клеток в течение суток при 28°С. Из отобранных клонов вы- деляют плазмидную ДНК и подтверждают ее идентичность препарату pPR-IL2-19 с помощью рестрикционного анализа. Полученный штамм E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IL2-19) депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ- В-3761.

П р и м е р 3. Получение штамма E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IL2-19).

Все операции осуществляют в соответствии с примером 2. Отличие состоит в том, что в качестве реципиента при трансформации используют штамм E.coli ВНИИгенетика VL 902 и в результате трансформации клеток этого реципиента плазмидой pPR- IL2-19 получают штамм E.coli ВНИИгенетика VL 902 (pPR-IL2-19) - продуцент интерлейкина-2 человека.

П р и м е р 4. Получение штамма E.coli C600-htpR(pPR-IL2-19).

Все операции осуществляют в соответствии с примером 2. Отличие состоит в том, что в качестве реципиента используют штамм E.coli СбОО-thpR, несущий дополнительно хромосомальную мутацию в гене htpR. В результате трансформации клеток этого реципиента плазмидой pPR-IL2-19 получают штамм E.coli СбОО-htpR (pPR-IL2- 19) (ВКПМ В-3828) - продуцент интерлейкина-2 человека.

П р и м е р 5. Определение продуктивности штаммов E.coli (pPR- L2-19) - продуцентов интерлейкина-2 человека.

Для определения продуктивности штаммов плазмидсодержащие клетки выращивают при 28°С на скошенной агаризозан- ной среде Хоттингера, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 14 ч. Выросшую на косяках биомассу используют для получения посевного материала. Для этого клетки переносят в колбы Эрленмейера объемом 750 мл со 100 мл среды Хоттингера, со 100 мкг/мл ампициллина и выращивают при 28°С на качалке при 240 об/мин в течение б ч. Оптическая плотность посеЕ.ной культуры составляет 1,5-2,5 ед.

Ферментацию проводят в ферментере. оснащенном системами регулирования рН, температуры, скорости перемешивания и аэрации. Для ферментации используют среду Хоттингера со 100 мкг/мл ампициллина и 10 г/л глюкозы. Посевную культуру вносят в количестве 5-10%. Культивирование осуществляют при рН 6,б-6,8, поддерживая этот уровень подачей аммиачной воды. Первую часть ферментации до 0. Д550 3,5 проводят при 28°С, а затем осуществляют термоиндукцию, повышая температуру до 42-45°С в течение 5 мин, после чего продолжают ферментацию еще 2 ч.

После окончания процесса для определения активности интерлейкина-2 челоиека

ИЗ 1 МЛ КуЛЬТурЭЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ КЛС. ТКИ

осаждают центрифугированием и осадок ресуспендируют в 1 мл 8 М раствора гу.эни- динхлорида при 20°С в течение 40 мин или 1 %-ном растворе додецилсульфата натрия в 0,02 М фосфатном буфере рН 7,2, содержащем 1% 2-меркаптоэтанола. В последнем случае образцы прогревают 2-4 мин при 100°С. Осадок отбрасывают центрифугированием и определяют активность содержащегося в надосадочной жидкости фракции интерлейкина-2.

Для определения доли синтезированного интерлейкина-2 человека от суммарного клеточного белка клетки из 1 мл культураль- ной жидкости осаждают центрифугированием и обрабатывают указанным образом. Препарат анализируют электрофорезом в 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0,1 % додецилсульфата натрия. Белки, разделенные в геле, прокрашивают в растворе Кумасси R-250. Количественное содержание белюв в зонах определяют после сканирования прокрашенного геля на автоматическом лазерном денситометре. Идентификацию зоны, соответствующей синтезированному в клетках зрелому интер- лейкину-2 человека, проводят на основе сравнения с электрофоретической подвижностью маркерных белков, а также с помощью блоттинга разделенных белков на нитро- целлюлозные фильтры с последующим про- явлением зон интерлейкина обработкой в растворах, содержащих мышиные монокло- нальные антитела против интерлейкина-2 t-v антимышиные кроличьи антитела, конъюги- рованные с пероксидазой из хрена. После соответствующей процедуры окрашивания зона интерлейкина проявляется в виде коричневой полосы на неокрашенном фоне нитроцеллюлозного фильтра.

Биологическая активность интерлейки- на-2 человека в различных плазмидных штаммах E.coli - продуцентах интерлейкина, а также доля синтезированного в клетках белкового продукта гена IL2 от суммарного белка представлены в таблице.

Таким образом, изобретение позволяет повысить продукцию интерлейкина-2 до 8- 10 х 107 международных ед. на 1 л бактериальной культуры, что составляет 12% от суммарного клеточного белка.

Формула изобретения 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPR-IL2-19, кодирующая синтез интерлейкина-2 человека, размером 3.85 т.п.н., содер- жащая BamHI-Bgfii-фрагмент векторной плазмиды pPR 124B размером 3,4 т.п.н., Cfr 13-ВдгЬ-фрагмент размером 0,45 т.п.н. плазмиды рАА1213-23, модифицированный введением Bgflj -линкера, ColEI-pe- пликон. ген температурочувствительного репрессора с Its 857 фага А, ген устойчивости к ампициллину. тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага fd, регулярную область PROR , SD-последователь- ность, ATG-инициирующий кодон гена его фага Я, кодирующую последовательность зрелого интерлейкина-2 человека гибридный участок связывания рибосом, имеющий следующую нуклеотидную последовательность: SVTAACCACCTTCTATCCCC..1. где TAAGGAGGT и АТС - SD-последовательность и индуцирующий кодон гена его соответственно, GCC-первый (Ala) кодон интерлейкина-2, а за терминирующим кодоном гена IL2 расположен тандем р -независимых терминаторов транскрипции fd, уникальные участки узнавания рестриктаз: Clal. координата которого является началом отсчета -0, Xbal -990 т.п.н., Bgfil - 1250 т.п.н., Pst-3070 т.п.н.

2. Способ конструирования рекомби- нантной плазмидной ДНК pPR-IL2-19. заключающийся в том, что введение уникального участка расщепления ВдШ в 3 -концевую нетранслируемую часть гена IL2 в составе плазмиды рАА1213-23 осуществляют с помощью олигонуклеотидного линкера, полученную плазмиду расщепляют рестриктазой Cfr 13 и достраивают образующиеся однонитевые концы молекул ДНК фрагментом Кленова ДНК-полимерэзы 1 Escherichia coll, образованный фрагмент плазмиды рАА1213-23В с геном IL2 интегрируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в состав векторной молекулы pPR124B. предварительно расщепленной BamHI и обработанный 51-эндонуклеазой, Затем препарат ДНК обрабатывают рестриктазой Bgfl и соединяют молекулу ДНК в кольцевую форму ДНК-лигазой, полученной смесью трансформируют клетки E.coli C600, трансформанты высевают на среду с ампи- циллином и культивируют при 28°С с последующей селекцией на пониженную скорость роста при температуре 42°С, из отобранных клонов выделяют плазмиду pPR-IL2-19, в которой точность воссоединения фрагментов проверяют восстановлением на стыке исходных участков ДНК, ранее отсутствовавшей последовательности узнавания рестриктазы BspRI.

3. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-3866 - продуцент интерлейкина-2 человека.

Штамм реципиент плаэмиды Биологическая активность

PPR-IL2- 19

E.coli C600 E.coli ВНИИгенетика

VL902 E.coli ВНИИгенетика

VL903

Доля интерлейкина от синтезируемого в клетках белка,%

8

9

12

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности. молекулярной биологии и генно-инженерной биотехнологии. Целью изобретения является повышение уровня накопления интерлейки- на-2(ИЛ-2) человека в клетках штамма-продуцента. Методами генной инженерии получена рекомбинантная плазмида pPR-IL2-19, которая обеспечивает регулируемый высокоэффективный синтез интерлейкина-2 человека в клетках E.coli под контролем промоторно- операторной области PROR бактериофага /.. Разработан способ конструирования этой плазмиды. Отобран штамм E.coli ВНИИге- нетика VL 903 (pPR-IL2-19) (регистрационный номер ВКПМ В-3866 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов), содержащий плазмиду pPR-IL2-19 и продуцирующий интерлейкин-2 человека в количестве 8-10 х 107 международных ед. на 1 л бактериальной культуры, что составляет 12% от суммарного клеточного белка. 3 с.п. ф-лы. 1 ил., 1 табл. На чертеже изображена физическая карта предлагаемой рекомбинантной плаз- мидной ДНК, Сконструирована новая рекомбинантная плазмида pPR-IL2-19 размером ,85 т.п.н. обеспечивающая экспрессию гена IL2 под контролем регуляторной области PROR . бактериофага А состоящая из большого 1-3,4 т.п.н.) BamHI-Bgfll-фрагмента векторной плазмиды pPR124B и малого (0,45 т.п.н.) С 13-ВдШ-фрагмента плазмиды рАА 1213- 23 (модифицированной введением Bgtll- линкера) и характеризующаяся следующими признаками: содержит участок иници(/) С VJ о со о ю со

TAAGGAGGTTG7A TGGCC

Clal

PstI

Ар

SVcro

f-met

Accl