Способ определения концентрации биополимеров в реакции связывания комплемента Советский патент 1991 года по МПК G01N33/68 

1

(21)4361953/13

(22)08,01.88

(46) 23.04.91. Бюл № 15

(71)Чечено-Ингушский государственный университет им Л.Н Толстого

(72)Г.А.Золенко

(53)543.9(088.8)

(56)Лабораторное дело, 1986, № 9, с0 548.

Иммунологические методы /Под ред, Г.Фримеля, 1987, М.: Медицина, с. 193.

(54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БИОПОЛИМЕРОВ В РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

(57)Изобретение относится к аналитической биохимии и может быть использовано для определения полипептидов

и нуклеиновых кислот в исследовательских лабораториях и лабораториях пищевой промышленности. Целью изобретения является упрощение способа и расширение спектра исследуемых веществ. Основу способа составляют две связанные реакции Первая представляет собой конкурентную ферментатив- ную систему: анализируемое вещество (полипептид, нуклеиновая кислота) - тест-антиген-фермент (пептидаза или

нуклеаза) Другая представляет постановку реакции связывания комплемента с участием тест-антигена, антисыворотки к нему и гемолитической системы. Способ допускает также анализ нуклеиновых кислот с нуклеаза- ми, В этом случае очистка нуклеиновых кислот не является необходимой Специфичность анализа здесь обеспечена ферментом и инактивированным вирусом, при этом активность антигенов возрастает при обработке ну- клеазой Способ содержит три блока операций: 1„ Хронометрическая инкубация анализируемого вещества и антигена в растворе фермента с последующей гго инактивацией, 2. Постановка реакции связывания комплемента в инкубате. 3 Учет глубинб гемолиза и определение количества анализируемого вещества по калибровочной зависимости. Количество анализируемого вещества пропорционально количеству гемолизированных эритроцитов Способ не требует получения специфической антисыворотки к исследуемому веществу и допускает возможность анализа большого числа полипептидов, выделенных, например, с помощью электрофореза. 2 табл„

даЬ

Изобретение относится к аналитической биохимии и может быть использовано для определения полипептидов и нуклеиновых кислот в исследовательских лабораториях и лабораториях микробиологической промышленности.

Цель изобретения - упрощение способа и расширение спектра исследуемых веществ

Пример 1 Для проведения анализа все необходимые растворы готовят с помощью взвешивания с точностью

до 0,1 мг на физиологическом растворе, имеющем рН 7,18 при 20°С„

Проводят определение количества заданных по весу высокоочищенных белков разной молекулярной массы и структуры. В определениях используют следующие кристаллические реакти- вы (наименование - молекулярная масса 10): -глобулин лошади 150; лактатдегидрогеназа бычья 136; гис- тон Hj 15,1; инсулин бычий 6,0.

В кинетическую систему, кроме инсулина г входят трипсин в концентрации 25 нг и антиген, представленный инактивированным аденовирусом 6 в культуре AI, имеющий концентрацию 40 нг.

Реагенты метрологической системы - специфическая сыворотка, комплемент, гемолизин, эритроциты барана - готовят в титрах, рекомендованных в прилагаемым к ним инструкциям по реакции связывания комплемента (РСК) - диагностике аденовирусных антител в сыворотке крови„

Кинетическую систему готовят в центрифужных пробирках путем смешения по 0,333 г каждой из ее рабочих концентраций и инкубирована в течени 30±0,05 мин в водяной бане при 37iO,2 C« Время дезактивации фермента 2 - 2,2 мин при 60-65 Со Все операции с растворами кинетической . системы проводят в условиях изоляции и обеспыленной атмосфере.

Остальные операции, постановка РСК и учет глубины гемолиза проводят согласно инструкциям по РСК-диагно стике с использованием прямого счета эритроцитов в камере Горяева Среднее их количество (О) в четырех больших квадратах принимают в качестве учетной величины для калибровочной зависимости

В табл. 1 приведены результаты анализа.

П р и м е р 2о Для анализа ДНК предварительно проводят сенсибилизацию 1 мг антигена к ДНКазе,

Сенсибилизация вируса основана на известном свойстве ДНК образовывать сплавы с некоторыми из биополимеров, Сплавление произведено в следующем режиме,,

Смешивают кристаллический антиген с кристаллической ДНК и бидистилли- рованной водой в соотношении масс 10:5:3-5. Экспонируют материал при

5

0

5

0

5

0

5

0

5

85-90 С в течение 1 ч« Охлаждают материал в течение 2-2,5 ч до комнатной температуры. Готовят рабочий раствор антигена с необходимым значением рН из полученного материала. Созревание раствора в течение суток при 4-5°С

При хранении на холоду рабочий раствор пригоден для использования в течение.10-15 сут„ Перед постановкой анализа необходим контроль активности антигена.

Из сенсибилизированного антигена готовят рабочий его раствор, обеспечивающий неполный гемолиз эритро- цитов в РСК (100-300 ед„ в учетном объеме). Кинетическую . систему в этом случае составляют из рабочей концентрации сенсибилизированного антигена, раствора ДНКазы и растворов ДНК в концентрациях 0;.50; 250; 1250 нг. В остальном порядок и режимы определения калибровочных зависи- „ мостей не отличаются от описанных в примере 1. Результаты калибровки приведены в табл. 1.

ПримерЗ. Результаты всех контрольных определений приведены в табл. 2 в порядке задано/определено.

Контрольный анализ ДНК проводят в сыворотке крови крысы, из которой удалены мешающие определению следы ДНК и подавлена собственная ДНКаз- ная активность следующими приемами: вводят в сыворотку ДНКазы (- 1,5 мкг/мл), инкубируют материал (2 ч, 37,7РС), вводят трипсин (1- 1,5 мкг/мл), инкубируют материал (3 ч, 37,), инактивируют фермент (20 мин, 65-70«С)0

При анализе ДНК в нативном материале первые две операции излишни.

Формула изобретения

Способ определения концентрации биополимеров в реакции связывания комплемента, включающий контактирование исследуемого вещества со специфическими антителами, комплементом и гемосистемой с последующим учетом результатов по глубине гемолиза эритроцитов, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и расширения спектра исследуемых веществ, исследуемое вещество предварительно инкубируют

с тест-антигеном - аденовирусом 6 в концентрации, обеспечивающей в постановочном опыте гемолиз 10 -107 эритроцитов, и ферментом, специфичным к исследуемому веществу и тест- антигену, в концентрации, обеспечивающей протекание конкурентной ферментативной реакции, далее фермент инактивируют, а полученную реакционную смесь контактируют со специфическими антителами к тест-антигену.

Таблица 1