СПОСОБ ПОСТАНОВКИ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/569 A61K39/10 

Патент относится к биотехнологии, а именно к проведению диагностических исследований при бруцеллезе.

Уже более ста лет как открыт возбудитель бруцеллеза, но до сих пор ведутся исследования по разработке методов выявления этого инфекционного заболевания.

Разработанные до настоящего времени диагностические средства очень разнообразны (реакция связывания комплемента РСК, реакция агглютинации по Райту РА, реакция длительного связывания комплемента РДСК, реакция Хеддльсона РХ, реакция Кумбса РК, Розбенгал проба РБП, реакция пассивной гемагглютинации РПГА, кольцевая реакция с молоком, иммуноферментный анализ) [1, 2, 3] . Однако в этих реакциях выявляются антитела только к S- или R-вариантам бруцелл [4, 5, 6].

Наиболее близким способом диагностики бруцеллеза, который следует взять за ближайший аналог, является постановка реакции длительного связывания комплемента, включающая в себя взятие крови у исследуемого объекта, получение сыворотки крови, приготовление требуемых разведений исследуемой сыворотки и добавления к ним S- или R-антигена с последующей инкубацией и учетом результатов [1].

Технический результат изобретения заключается в получении комплексного диагностикума, применяемого для одновременного выявления специфических бруцеллезных антител как к S-, так и к R-вариантам бруцелл.

Предлагаемый способ заключается в том, комплексный диагностикум получают путем смешивания S- и R-антигенов бруцелл, а сыворотки в одной тест-системе одновременно исследуются на наличие антител как к S-, так и R-антигенам бруцелл.

Патент иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Реакцию длительного связывания комплемента проводят согласно наставлению по постановке РСК и РДСК. Компоненты реакции и их подготовка к работе - исследуемые положительные S- и R- и отрицательные сыворотки прогревают в водяной бане при 63-64^oС в течение 30 мин. Используют бруцеллезный единый антиген для РА, РСК и РДСК для выявления S-антител и овисный антиген для выявления R-антител в рабочем титре, указанном предприятием изготовителем. Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором. Гемолизин используют в утроенном титре. Используют 3%-ную взвесь эритроцитов барана. Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и гемолизин в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в термостате при 37^oС в течение 15-20 минут.

Постановка реакции. В первый день проводят розлив и инактивацию испытуемых и контрольных сывороток для главного опыта и для титрования гемолитической системы. Контроль компонентов реакции на антикомплементарность и гемотоксичность. Каждую сыворотку разливают на три пробы, делают последовательные разведения начиная с 1:5 и до 1:320 в объеме 0,2 мл. К первой пробе добавляют 0,2 мл бруцеллезного единого антигена для PA, PCK и РДСК для выявления S-антител, ко второй пробе 0,2 мл овисного антигена для выявления R-антител, к третьей пробе добавляют 0,2 мл смеси антигенов - бруцеллезного единого для РА, PCK и РДСК и овисного антигена, причем в третьем случае используют антигены, смешанные в соотношении 1:1 с удвоенным рабочим титром. После добавления антигена к сывороткам добавляют комплемент в объеме 0,2 мл и пробирки помещают в холодильник при 2-6^oС на 16-18 часов. Подготавливают гемолитическую систему, которую также помещают в холодильник. На второй день пробирки с исследуемыми образцами и гемолитическую систему достают из холодильника выдерживают при комнатной температуре 20 минут. Титруют гемолитическую систему. Определяют его рабочую дозу. Гемолитическую систему в рабочей дозе вносят в пробирки с исследуемыми сыворотками и помещают в водяную баню при 37-38^oС на 20 минут. В качестве контроля гемолитической системы ставят пробирки без сыворотки, антигена и комплемента. С одной гемолитической системой в рабочем титре, а также отрицательные сыворотки.

Учет реакции проводят визуально через 3-4 часа после извлечения из водяной бани. Результаты оценивают в крестах по следующей схеме:
(++++) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная;
(+++) - гемолиз 25% эритроциты;
(++) - гемолиз 50% эритроциты;
(+) - гемолиз 75% эритроциты;
(-) - полный гемолиз эритроцитов осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 2. Аналогичен примеру 1 только в качестве R-антигена используют антиген, полученный из штамма Бруцелла абортус В-1, находящегося в R-форме. Результаты представлены в таблице 2.

Пример 3. Аналогичен примеру 1, только используют бруцеллезный единый антиген для PA, PCK и РДСК и овисный антиген в рабочих разведениях. Результаты представлены в таблице 3.

Пример 4. Аналогичен примеру 1, только соотношение бруцеллезного единого антигена для PA, PCK и РДСК и овисного антигена в рабочих разведениях 1:2. Результаты представлены в таблице 4.

Пример 5. Аналогичен примеру 1, только соотношение бруцеллезного единого антигена для РА, PCK и РДСК и овисного антигена в рабочих разведениях 3:1. Результаты представлены в таблице 5
Пример 6. Реакцию пассивной гемагглютинации проводят согласно наставлению по постановке РПГА и РНАТс диагностикумом эритроцитарным антигенным сухим. Исследуемые заведомо положительные и отрицательные S- и R-сыворотки разводят 1: 5 изотоническим раствором хлорида натрия и прогревают в течение 20 минут при 56^oС.

Нормальную 10%-ную кроличью сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия в 10 раз до получения 1% концентрации. Каждую сыворотку исследуют в трех вариантах с S-, R-, и S-R-диагностикумом. В качестве антигенов соответственно используют фабричный лиофилизированный эритроцитарный диагностикум для выявления антител к S-антигену, эритроциты сенсибилизированные R-антигеном, а также смесь этих двух диагностикумов в соотношении 1:1 в двойных рабочих разведениях.

РПГА ставят в U-образных лунках панелей для микротитратора. В лунки вносят по 0,05 мл 1%-ного раствора НКС, затем в лунки первого ряда добавляют исследуемые сыворотки в объеме 0,05 мл, перемешивают и делают двукратные разведения (начиная с 1:5 и до 1:1280). Затем во все лунки добавляют по 0,025 мл 1%-ной взвеси диагностикума. Одновременно с реакцией ставят следующие контроли: проверка отсутствия спонтанной агглютинации диагностикума - в 2-4 лунки наливают по 0,05 мл 1%-ного раствора НКС и по 0,025 мл 1%-ной суспензии диагностикума. Эритроциты во всех лупках оседают в виде кольца. Панель встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Реакцию учитывают через 1,5-2 часа по общепринятой методике:
(++++) - резкоположительная реакция: агглютинированные эритроциты образуют перевернутый зонтик, края которого опадают;
(+++) - положительная реакция: агглютинированные эритроциты образуют перевернутый зонтик с ровными краями;
(++) - слабоположительная реакция: по краю агглютинированных эритроцитов намечается тонкое кольцо из не агглютинированных эритроцитов;
(+) - сомнительная реакция: по краю агглютинированных эритроцитов располагается широкое кольцо из не агглютинированных эритроцитов;
(-) - отрицательная реакция: эритроциты оседают на дно лунки в виде диска или кольца. Результаты представлены в таблице 6.

Пример 7. Аналогичен примеру 6, только соотношение антигенного диагностикума к S- антигену и антигенного диагностикума к R- антигену в рабочих разведениях 1:1. Результаты представлены в таблице 7.

Пример 8. Аналогичен примеру 6, только соотношение антигенного диагностикума к S-антигену и антигенного диагностикума к R-антигену 1:2 в рабочих разведениях. Результаты представлены в таблице 8.

Пример 9. Аналогичен примеру 6, только соотношение антигенного диагностикума к S-антигену и антигенного диагностикума к R-антигену в рабочих разведениях 2:1. Результаты представлены в таблице 9.

Пример 10. Постановка кольцевой реакции с молоком. Реакция проводят согласно наставлению по постановке кольцевой реакции с молоком. Компоненты реакции: исследуемое молоко от заведомо больных животных, антиген цветной бруцеллезный для КР с молоком, антиген овисный для РДСК, положительные S- и R- сыворотки, отрицательные сыворотки. Постановка реакции. Каждую пробу молока исследуют с тремя антигенами: антиген цветной бруцеллезный для КР с молоком, антиген овисный для РДСК и их смесью в соотношении 1:1. В пробирки разливают антиген в объеме 0,1 мл, затем шприцом толчками наливают пробу молока в объеме 2 мл и тщательно перемешивают. Одновременно с реакцией ставят контроли с молоком заведомо здоровой коровы, со смесью молока здоровой коровы и позитивными S- и R-сыворотками (0,05 мл сыворотки на 1 мл молока). Пробирки помещают в водяную баню при 37-38^oС на один час.

Учет результатов проводят сразу после инкубации проб.

+++ (3 креста) - четко выраженное кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть белая.

++ ( 2 креста) - достаточно выраженное синее кольцо в слое сливок, остальная часть имеет синеватый оттенок,
+ (1 крест)- синее кольцо в слое сливок слабо выражено. Весь столбик молока имеет синий цвет.

- (минус) - столбик молока остается равномерно окрашенным в синий цвет, а слой сливок белого или желтоватого цвета.

Результаты представлены в таблице 10.

Пример 11. Выявление антител к S- и R-антигенам бруцелл иммуноферментным методом. В качестве S-антигена используют липополисахарид, выделенный из штамма Бруцелла абортус 19, находящегося в S-форме. В качестве R-антигена используют солевой антиген, выделенный из штамма Бруцелла абортус В-1, находящегося в стабильной R-форме. Антигены R- в S- разводят до концентрации 1 мкг/мл карбонатно-солевым буфером рН 9,6,и смешивают в соотношении 1:1 и вносили в лунки платы для микротитрования по 200 мкл. Для сенсибилизации плашки используют и смесь этих антигенов, но в концентрации 2 мкг/мл каждый. Платы закрывают крышками и инкубируют 2 дня при 4^oС. Перед постановкой реакции платы промывают 0,15% раствором твина 20. Исследуемые положительные и отрицательные сыворотки разводят 1:40 в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,05% твина-20 (ФСБ-Т), и разливают по 200 мкл в лунки платы, причем каждую исследуемую сыворотку наливают в три лунки: первую, содержащую R-антиген, вторую в S-антиген и в третью, содержащую смесь R- в S-антигенов. Инкубируют 15 минут при 37^oС. Затем удаляют растворы из лунок, заполняют их нагретым до 37^oС раствором ФСБ-Т, инкубируют 5 минут при 37^oС, промывают раствором твина-20. В каждую лунку добавляют раствор ферментного конъюгата (на основе кроличьих антител против IgG морской свинки) разведенный ФСБ-Т в 1500 раз и инкубируют 15 минут при 37^oС. После инкубации лунки промывают нагретым до 37^oС раствором ФСБ-Т и дистиллированной водой и затем обрабатывают раствором, содержащим субстрат (0,03% Н₂О₂) и хромоген (0,1% о-фенилендиамин) на основе 0,07 М ФСБ-Т, рН 5,0. Реакцию останавливают добавлением 8 н. серной кислоты (50 мкл/лунку). Поглощение измеряют при длине волны 492 нм. Положительной считают реакцию, если показатель оптической плотности исследуемой сыворотки превышает аналогичный показатель заведомо отрицательной сыворотки в два раза. Результаты представлены в таблице 11.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенный способ получения комплексного S-R- диагностикума позволяет в различных серологических реакциях за одно исследование выявлять титры антител к бруцеллезной инфекции находящейся как в S-, так и R-формах, причем данный способ постановки серологических реакций по своей чувствительности не уступает общепринятым методикам, предложенный комплексный S-R-диагностикум может найти применение при выявлении животных больных как S-, так и R-формами бруцеллеза.

Источники информации
1. Наставление по диагностике бруцеллеза животных Утверждено ГУ ветеринарии МСХ СССР 30.12.1982.

2. Тихомирова Е.А., Григорьева Г.И., Игнатов П.Е. Экспресс-метод обнаружения противобруцеллезных антител в сыворотке крови. Тезисы докладов научно-производственной конференции. Горький, 1988, с. 12-13.

3. Джалилов К.Д., Имомолиев У.Н. Бруцеллез у детей. Ташкент, 1990.

4. Белозеров Е.С. Бруцеллез. Л., 1985.

5. Вершилова П.А., Чернышева М.И., Князева Э.Н. Патогенез и иммунология бруцеллеза. М.: Медицина, 1974.

6. Триленко П.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. Л.,1976.

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для диагностики бруцеллеза. Способ постановки диагностической реакции при бруцеллезе включает подготовку комплексного диагностикума, представляющего собой смесь S- и R-антигенов бруцелл в соотношении 1-3:1-3, контактирование его с исследуемым материалом - сывороткой крови - в присутствии тест системы и учет результатов реакции. Наиболее оптимальными являются соотношения S- и R-антигенов 1: 1 или 1:3. Использование способа позволяет одновременно выявлять специфические бруцеллезные антитела к S- и R-вариантам бруцелл без снижения специфичности и чувствительности реакции. 5 з.п.ф-лы, 11 табл.

1. Способ постановки диагностической реакции при бруцеллезе, включающий подготовку диагностикума, контактирование его с исследуемым материалом в тест-системе с последующим учетом полученных результатов реакции, отличающийся тем, что в качестве диагностикума используют комплексный диагностикум, представляющий собой смесь S- и R-антигенов бруцелл в соотношении 1-3:1-3. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что комплексный диагностикум представляет собой смесь S- и R-антигенов бруцелл в соотношении 1:1. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что комплексный диагностикум представляет собой смесь S- и R-антигенов бруцелл в соотношении 2:1. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что комплексный диагностикум представляет собой смесь S- и R-антигенов бруцелл в соотношении 1:2. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что комплексный диагностикум представляет собой смесь S- и R-антигенов бруцелл в соотношении 3:1. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что комплексный диагностикум представляет собой смесь S- и R-антигенов бруцелл в соотношении 1:3.