Способ получения метафазных хромосом клеток крови животных Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биологии, в частности к цитогенетике сельскохозяйственных животных, и может найти применение при проведении цитогенети- ческого анализа животных для выявления хромосомных нарушений, приводящих к снижению продуктивности

Цель изобретения - повышение выхода метафазных хромосом

Для реализации способа используют питательную среду следующего состава: среда 199 18-22 мл; фитогемагглютинин 1,7-2,2 мл; пенициллин 10000 ед, стрептомицин 5000 ед; кровь исследуемого животного 15-25 мл; остальное до 100 ил среда Игла и дополнительно проводят обработку при (-1)-(+1) С в течение 12-15 мин

Пример 1 „ Из яремной вены животных берут кровь в стерильные пробирки 15-25 мл крови вносят в питательную среду следующего состава: среда 199 18-22 мл; ФГА 1,7-2,2-мл; пенициллин 10000 ед; стрептомицин 5000 ед; остальное до 100 мл среда Игла о По 10 мл смеси помещают в куль- туральные матрасы и инкубируют 72 ч при 37,2°С, Через 20 ч после начала культивирования проводят холодовую рбработку, ставя матрасы с культурой на лед 12-15 мин0 Затем продолжают культивирование при 37,2 С„ На 68 часу культивирования вносят колхицин 0,3 мкг/мл (на 1 мл смеси) для накопления митозов0 После окончания культифирования смесь перенрсят(

о

4

сл

N3

СО sj

20

в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в 5 мл гипотони- 5 ческого раствора КС1 20-25 мин Затем клеточную суспензию вновь центрифугируют и осадок проводят трижды через фиксатор (метанолгуксусная кислота, 3:1), осаждая клетки центри-10 фугированием в прежних режимах Когда осадок станет чистым, добавляют 2-3 мл фиксатора и кашпо такой суспензии наносят на влажные предметные стекла Готовые цитологические пре- 15 параты можно окрашивать.

Исходя из данных табл. 1, видно, что митотический индекс культур клеток крови животных по предлагаемому способу выше и составляет 20,4+0,45, по прототипу 14,0+0,37. Это говорит о наличии наибольшего числа делящихся клеток, культивируемых предлагаемым способом, необходимых для анализа кариотипа. исследуемых животных о

Для получения оптимального варианта среды, используемой для получения наибольшего количества митозов, приводят пять примеров различного состава среды и различных параметров обработки.

В каждом препарате просматривают не менее 2000 клеток, учитывая число клеток, находящихся в состоянии митоза. Показателем активности деления клеток служит митотический индекс, т.е,, отношение числа клеток, находящихся в митозе, к числу исследованных клеток, выраженное в промилле

25

30

35

Пример 3„ Среда 199 18 мл; ФГА 1,7 мл; пенициллин 10000 ед; стрептомицин 5000 ед; кровь 15 мл; остальное до 100 ил среда Игла„

Пример 4. Среда 199 20 мл; ФГА 2 мл; пенициллин 10000 ед; стреп томицин 5000 ед; кровь 20 мл; осталь ное до 100 мл среда Игла0

Пример 5о Среда 199 22 мл; ОГА 2,2 мл; пенициллин 10000 ед; ,стрептомицин 5000 ед; кровь 25 мл; остальное до 100 мл среда Игла0

Пример 6„ Среда 199 25 мл; ФГА 2,5 мл; пенициллин 10000 ед; стрептомицин 5000 ед; кровь 30 мл; остальное до 100 мл среда Игла„

Исходя из данных, наиболее оптимальной средой является среда из при мера 4 „ Митотическая активность куль туры клеток в данной среде при обработке от (-1) до (+1)°С в течение 12-15 мин достигает 30,511,23.

В средах примеров 3 и 5 митотичес кая активность культур средняя и дос тигает 23,0+1,07 и 19,5+0,99 Минимальная активность культур наблюдает ся в средах примеров 2 и 6 17,0+0,92

Формула изобретения

Способ получения метафазных хромо сом клеток крови животных, включающи забор крови, культивирование ее на пи тательной среде с последуюцим внесением колхицина, гипотонизацией, фикс цией и окраской, отличающий- с я тем, что, с целью повышения выхода метафазных хромосом, кровь беру

Vт - - - оAW,U,CI гас 1 Civil сип О1Л AyurHJUVJM, Utipy

Полученные результаты обработаны ста- 40 в количестве 15-25 мл, культивироватистически по Рокицкому

В следующих примерах последовательность обработки материала аналогична примеру 1.

Пример 2. Среда 199 15 мл; ФГА 1,5 мл; пенициллин 10000 ед; , стрептомицин 5000 ед; кровь 10 мл; остальное до 100 мл среда Игла

45

Таблица

Митотическая активность культур клеток крови животных

ние проводят на среде следующего состава: среда 199 18-22 мл; фитогемаг- глютинин 1,7-2,2 мл; пенициллин 10000 ед; стрептомицин 5000 ед; среда Игла до 100 мл, а перед внесением колхицина культуру клеток в течение 12-15 мин выдерживают при (-1)- (+1)°С.

1

0

. 5 0 5

5

0

Пример 3„ Среда 199 18 мл; ФГА 1,7 мл; пенициллин 10000 ед; стрептомицин 5000 ед; кровь 15 мл; остальное до 100 ил среда Игла„

Пример 4. Среда 199 20 мл; ФГА 2 мл; пенициллин 10000 ед; стрептомицин 5000 ед; кровь 20 мл; остальное до 100 мл среда Игла0

Пример 5о Среда 199 22 мл; ОГА 2,2 мл; пенициллин 10000 ед; ,стрептомицин 5000 ед; кровь 25 мл; остальное до 100 мл среда Игла0

Пример 6„ Среда 199 25 мл; ФГА 2,5 мл; пенициллин 10000 ед; стрептомицин 5000 ед; кровь 30 мл; остальное до 100 мл среда Игла„

Исходя из данных, наиболее оптимальной средой является среда из примера 4 „ Митотическая активность культуры клеток в данной среде при обработке от (-1) до (+1)°С в течение 12-15 мин достигает 30,511,23.

В средах примеров 3 и 5 митотичес- кая активность культур средняя и достигает 23,0+1,07 и 19,5+0,99 Минимальная активность культур наблюдается в средах примеров 2 и 6 17,0+0,92.

Формула изобретения

Способ получения метафазных хромосом клеток крови животных, включающий забор крови, культивирование ее на питательной среде с последуюцим внесением колхицина, гипотонизацией, фиксацией и окраской, отличающий- с я тем, что, с целью повышения выхода метафазных хромосом, кровь берут

AW,U,CI гас 1 Civil сип О1Л AyurHJUVJM, Utipy

в количестве 15-25 мл, культивирова

аблица

ние проводят на среде следующего состава: среда 199 18-22 мл; фитогемаг- глютинин 1,7-2,2 мл; пенициллин 10000 ед; стрептомицин 5000 ед; среда Игла до 100 мл, а перед внесением колхицина культуру клеток в течение 12-15 мин выдерживают при (-1)- (+1)°С.

1

Таблица 2

Изобретение относится к биологии, в частности к цитогенетике сельскохозяйственных ответных и может найти применение при проведении цитогенети- ческого анализа животных для выявления хромосомных нарушений, приводящих к снижению продуктивности. Целью изобретения является повышение выхода метафазных хромосом Для этого клетки крови животных культивируют на среде, содержащей фитогемагглютинин, стрептомицин,пенициллин, среду 199, среду Игла, а перед внесением колхицина выдерживают в течение 12-15 мин при Р (-1Ы+1)°С, 6 табл„ (Л

Миготическая активность культур клеток крови животных на данной среде при ра-эличных параметрах обработки

Митотическая активность культур клеток крови животных на данной среде при различных параметрах обработки

Таблица

Нитотическая активность культур клеток крови животных на данной среде при различных параметрах обработки

Митотическая активность культур клеток крови животных на данной среде при различных параметрах обработки

Таблица 3

Таблица 5

Митотическая активность культур клеток крови животных на данной среде при различных параметрах обработки