Штамм перевиваемых клеток невриномы гассерова узла крысы НГУК-1,используемый для изоляции полевых штаммов рабического вируса,экспресс-диагностики бешенства,определения глиотоксичности сывороток крови и титрования интерферона Советский патент 1985 года по МПК C12N5/00 

со :о

сз а

Изобретение относится к цитологии и вирусологии.

Известен штамм глиальных переви- ваемых клеток из дифференцированной астроцитомы человека, полученный в 1961 г в СССР C1 }

Однако к настоящему времени штамм утерян.

Целью изобретения является создание нового штамма перевиваемых глиальных клеток, способного культивироваться на отечественных средах, отвечающего мировым стандартам и пригодного для вирусологических исследований.

Эта цель достигается с использованием штамма перевиваемых клеток невриномы гассерова узла крысы HITK-1. Штамм депонирован в коллекции соматических перевиваемых клеток позвоночных Института эксперименталь ной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко.

Штймм перевиваемых клеток НГТК-1 получен путем последовательного пассирования индуцированной этилнитрозомочевиной опухоли гассерова узла крысы во флаконах с питательной средой и на восприимчивых животных.

Штамм характеризуетсяследующими морфологическим -} и биологическими свойствами.

Клетки имеют полигональную форму с тонкими отростками, цитоплазма не вакуолизирована, ядро содержит мелко- и крупнозернистый хроматин с 2-3 ядрьш ками. В штамме НГУК-1 сохраняется околодиплоидное число хромосом. При постановке пробы на глиоспецнфический белок S-100 обнаружена положительная реакция. Клетки НГУК-1 образуют монослой на 3-4 сут роста при исходной плотности пассирования 150 тыс. клеток на 1 МП, при большей плотности пассирования - на 2 сут. Максимальный митотический индекс - 2,5%. Штамм НГУК-1 не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами. Клетки НГУК-1 сохраняются в жидком азоте без снижения пролиферативной активности. При хранении более 2 лет (время наблюдения) сохраняют жизнеспособность на 75-80%. Клетки НГУК-1 способны оставаться на стекле без субкультивирования и смены среды в течение 5-7 сут, чувствитель ны к различным вирусам (уличного бешенства, везикулярного стоматита.

Синдбис, клещевого энцефалита, Кок.саки А7), пригодны для определения И титрования глиотоксичности сывороток крови и титрования интерферона.

Пример 1. Вьщеление полевых штаммов рабического вируса и экспресс-диагностика бешенства.

Монослой клеток линии НГУК-1 выращенный в О,1 или 0,25 л матрасных колбах, обрабатьгаают 0,025%-ным раствором версена в течение 1,5-2 ми при комнатной температуре. Версен сливают и в колбу вносят 2-3 мп питательной среды Игла МЕН с глутамном (65%), телячьей сывороткой (15%), сывороткой крупного рогатого скота (15%) и куриным эмбриональным экстрактом (5%) и по 100 ед. пенициллина и стрептомицина. Клетки разбивают при легком покачивании кобы или с помощью пипетирования. Дал вносят среду Игла МЕН, чтобы концентрация клеток составляла 500 000 на 1 мл. Затем взвесь клеток переносят в бактериологические пробирки содержащие на дне предметные стекла размерами 5x20 мм, и помещают их в термостат (37С) . Монослой формируется через 48 ч с момента посадки

Исследуемый и контрольный материал (мозг или подчелюстные железы человека или различных животных, сохраняемые при -20С) размельчают в асептических условиях, готовят 10%-ную взвесь в фосфатном буферном растворе с рН 7,2, центрифугируют при 5000 оборотов в минуту в течение 10 мин.

Надосадочную жидкость с антибиотиками сохраняют при 2-4°С.

Перед заражением культуры пробирки с предметными стеклами микроскопируют при увеличении 5x7 и отбирают пробирки с удовлетворительным монослоем клеток. Ростовую среду удаляют, монослой клеток промывают раствором Эрла и на него вносят 0,3 мл исследуемого материала для адсорбции в течение 1 ч при комнатной температуре. Исследуемый материал удаляют и в каждую пробирку вносят по 2,5 мл среды Игла MEM с указанными вьш1е добавлениями. В качестве контроля используют нормальную мозговую взвесь и заведомо положительный вируссодержащий материал. Для каждого исследуемого и

Штамм перевиваемых клеток невриномы гассерова узла крысы НГУК-1 (коллекция соматических перевиваемых клеток позвоночных Института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко), используемый для изоляции полевых штаммов рабии ческого вируса, экспресс-диагностики бешенства, определения глиотоксич(Л ности сывороток крови и титрования интерферона. .