СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ Российский патент 2013 года по МПК C12N5/07 C12N5/71 

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и касается культивирования клеток человека и животных, необходимых для производства вирусных вакцин, диагностикумов, получения моноклональных антител, биологически активных веществ, проведения диагностических исследований.

Необходимым компонентом питательных сред является сыворотка крови, без которой большинство культур клеток тканей человека и животных не растет in vitro. Сыворотка способствует размножению клеток, обуславливает их длительное прикрепление к субстрату, а также выполняет целый ряд регуляторных функций.

Известны способы культивирования клеток человека и животных с использованием сыворотки крови крупного рогатого скота (Общая и частная вирусология / Под редакцией В.М. Жданова. М., 1982. том 1. С.479-484; Животная клетка в культуре/ Под редакцией Л.П. Дьяконова и В.И. Ситькова. М. «Компания Спутник». 2000. С.67-88; Подчерняева Р.Я., Хижникова Т.М., Ткаченко А.В., Поликарпова С.С. Использование отечественных сывороток различных видов животных для культивирования клеточных культур. Вирусы и вирусные заболевания. 1990. №18. С.89-91). Недостатками являются нестандартность, возможная контаминация вирусами и микоплазмами, содержание различных ингибиторов, задерживающих рост клеток и репродукцию вирусов.

Кроме того, одним из сдерживающих факторов в широком применении сыворотки крови крупного рогатого скота является наличие в ней антител ко многим возбудителям вирусных инфекций и, в первую очередь, таким, как парагрипп-3, инфекционный ринотрахеит, аденовирусная инфекция, вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек, рота- и коронавирусные энтериты крупного рогатого скота. Наличие в сыворотке крови этих антител снижает результативность исследований в направлении адаптации штамма, выделения цитопатогенного вируса из патологического материала с целью постановки диагноза и, наконец, делает малоэффективным путь промышленного изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Для клеточной биотехнологии также предложены: - сыворотка крови северных оленей, - плодов крупного рогатого скота (ТУ 10-07-275-85; Гуненков ВВ., Сухарев О.И., Сирота В.Ф. Свойства сыворотки крови северных оленей и результаты применения ее в вирусологии и биотехнологии. Вопросы вирусологии. 2003. №6. С.37-41; Баландин И.Г., Извекова А.В., Шторм Г.Г., Пугачева М.И. Методы получения, стерилизации и контроля сыворотки крови плодов крупного рогатого скота. Бюллетень ВИЭВ. 1983. Вып.49. С.42-45; Хаертынов К.С., Дьяконов Л.П., Винтер В.Г., Белова М.М. Фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота. Ветеринария. 1990. №3. С.62-63).

Все эти сыворотки выпускаются в ограниченных количествах и полностью не удовлетворяют потребностей биотехнологии и вирусологии. Поэтому необходимы дальнейшие изыскания новых источников получения качественной и высокоактивной сыворотки крови для выращивания культур клеток.

Целью данного изобретения является повышение пролиферативной активности клеток за счет улучшения ростовых и адгезивных свойств питательной среды.

Пример 1. Культивирование клеток эпидермоидной карциномы гортани человека (НЕр-2).

Во флакон со средой Игла+199 (смесь равных количеств среды Игла и среды 199) после добавления антибиотиков, из расчета: пенициллин - 100 ед./мл, стрептомицин - 100 мкг/мл, пипеткой вносят сыворотку крови плодов буйволиц, в следующем объемном соотношении компонентов, %: среда - 95; сыворотка 5. Клетки НЕр-2 суспендируют в приготовленной таким образом среде, доводя их концентрацию до 100000 кл./мл. По 10 мл суспензии клеток пипеткой, при соблюдении условий асептики, вносят в культуральные флаконы, с рабочей поверхностью 20 см². Флаконы помещают в термостат при 37°С. Через 3-4 суток культивирования формируется монослой клеток с типичной морфологией.

На вторые-третьи сутки культивирования клетки НЕр-2, выращиваемые с фетальной сывороткой, образовали сплошной монослой, тогда как с сывороткой крови крупного рогатого скота формирование монослоя отставало.

Процент адгезии через 4 ч при использовании питательной среды с экспериментальными сыворотками плодов буйволиц серий 1, 2 и 3 составил 8,8; 8,9 и 8,7 соответственно, в то время как в контроле он равнялся 6,3 (при посевной дозе клеток 100000 кл./мл). Высокий процент прикрепления клеток к стенке флаконов наблюдался через 14 часов культивирования: в экспериментальной сыворотке - 36,2; 38,5 и 37,7, в контрольной сыворотке - 33,8, соответственно.

Пример 2. Культивирование перевиваемой линии клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК).

Во флаконы с питательной средой Игла после добавления антибиотиков, из расчета: пенициллин - 100 ед./мл, стрептомицин - 100 мкг/мл, пипеткой вносят сыворотку крови плода буйволицы, в следующем объемном соотношении компонентов, об., %: среда - 93; сыворотка - 7. Клетки ЛЭК суспендируют в приготовленной таким образом среде, доводя их концентрацию до 150000 кл./мл. По 10 мл суспензии клеток пипеткой, при соблюдении условий асептики, вносят во флаконы, с рабочей поверхностью 20 см². Флаконы помещают в термостат при 37°C. Через 2-3 суток культивирования формируется монослой клеток с типичной морфологией.

На вторые сутки культивирования клетки ЛЭК, выращиваемые в среде с сывороткой крови плодов буйволиц, размножались интенсивно и формировали крупноочаговый монослой, тогда как в среде с сывороткой крови крупного рогатого скота число делящихся клеток на одно поле зрения было меньше.

Индекс пролиферации при использовании сыворотки крови плодов буйволиц в 3 сериях составил 2,8; 3,4 и 3,6, в среднем - 3,27±0,24, по сравнению с 2,8, при использовании бифабричной сыворотки крови крупного рогатого скота (при посевной дозе 150000 кл./мл). Жизнеспособность клеток колебалась от 74 до 100%.

Питательные среды (Игла, 199), содержащие сыворотку крови плодов буйволиц, обеспечивают достаточно высокую адгезивную, митотическую и пролиферативную активность, в концентрации 5-7% перевиваемых линий клеток НЕр-2 и ЛЭК.

Предлагаемый нами способ позволяет значительно удешевить процесс культивирования клеток и обеспечить получение на клеточных субстратах различных биологически активных веществ.

Список использованной литературы

1. Баландин И.Г., Извекова А.В., Шторм Г.Г., Пугачева М.И. Методы получения, стерилизации и контроля сыворотки крови плодов крупного рогатого скота. Бюллетень ВИЭВ. 1983. Вып.49. С.42-45.

2. Бердникова З.Е., Петручук Е.М., Шалунова Н.В., Ночевный В.Т. Методические указания «Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на отсутствие вирусов-контаминантов и микоплазм». Утверждены Минздравом СССР 1988 г. М.: 1988. 18 с.

3. Гуненков В.В., Сухарев О.И., Сирота В.Ф. Свойства сыворотки крови северных оленей и результаты применения ее в вирусологии и биотехнологии. Вопросы вирусологии. 2003. №6. С.37-41.

4. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Под редакцией Л.П. Дьяконова и В.И. Ситькова. М. «Компания Спутник». 2000. С.67-88.

5. Михайлова Г.Р., Подчерняева Р.Я. Изучение ростстимулирующей активности отечественных сывороток различных видов животных. Вопросы вирусологии. 1990. №5. С.426-429.

6. Общая и частная вирусология/ Под редакцией В.М.Жданова. М., 1982. том 1. С.479-484.

7. Подчерняева Р.Я., Хижникова Т.М., Ткаченко А.В., Поликарпова С.С. Использование отечественных сывороток различных видов животных для культивирования клеточных культур. Вирусы и вирусные заболевания. 1990. №18. С.89-91.

8. Хаертынов К.С., Дьяконов Л.П., Винтер В.Г., Белова М.М. Фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота. Ветеринария. 1990. №3. С.62-63.

Изобретение относится к области цитологии и биотехнологии. Предложен способ культивирования клеток человека и животных на питательной среде, содержащей сыворотку крови плодов буйволиц в объемном соотношении 5-7% сыворотки и 93-95% среды, с последующим инкубированием культур при 37°C в течение 3-5 суток до формирования монослоя. Изобретение может быть использовано для культивирования клеток в культуре. 2 пр.

Способ культивирования клеток животных, в том числе человека, путем засева клеточной суспензии на питательную среду, дополнительно содержащую сыворотку крови животных, с последующим инкубированием культур при 37°C в течение 3-5 суток до формирования монослоя, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в присутствии сыворотки крови плодов буйволиц, при следующем объемном соотношении компонентов, об.%:
Синтетическая питательная среда 93-95 Сыворотка крови плодов буйволиц 5-7