Способ получения мутантов у спорообразующих бактерий SтRертомYсеS и СLоSтRIDIUм асетовUтYLIсUм Советский патент 1991 года по МПК C12N15/01 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частнос- 4 ти к получению мутантов промышленных штаммов актиномицетов и анаэробной бактерии Clostridium acetobutylicunu

Цель изобретения - повышение выхода мутантов с минимальным числом множественных мутаций при увеличении абсолютного числа мутантов в популяции клеток

Способ осуществляют следующим образом

Применительно к актиномицетам: на чайки с минимальной средой, содержащей необходимые факторы роста, наносят полужидкий агар того же состава, содержащий споровую суспензию культуры и раствор мутагена в нужной концентрации. На определенной стадии прорастания спор смесь центрифугируют, отмывают физиологическим раствором или дистиллированной водой и рассевают на чалки со средами, содержащими антибиотики в определенных концентрациях в качестве селективных агентов, для подсчета мутантов Ant , устойчи- вых к антибиотикамо

Применительно к С0 acetobutylicum: споры вносят в полужидки агар, содержаний гутаген в нужной концентра-, ции, и эту смесь наносят на чашки с твердым слоем агара, содержащие в качестве селективного агента антибиотик. Чайки инкубируют в анаэроб-, ных условиях при 37°С в течение 64- 72 ч и отбирают мутанты, устойчивые к антибиотикуо

О5

сл

Од

Мутагенную обработку прорастающих спор Со acetobutylicum производят в слое полужидкого агара, как и в случае актиномицетов Однако из-за чувствительности анаэробных бактерий к кислороду нет возможности определить число выживших клеток традиционным методом разведения Поэтому учет мутантов С acetobutylicum произво- дят путем подсчета абсолютного числа выросших на селективной среде колоний с

Пример 1 о Определение эффективности мутагенного действия N-метил-К-нитро-И-нитрозогуанидина (НГ) „

На чашки с минимальной средой, содержащей в качестве факторов роста необходимые концентрации крахмала и дрожжевого экстракта, наносят полужидкий агар со споровой суспензией клеток So aureofaciens ТВ 633 ФУ и НГ в разных концентрацияхо После прорастания спор до определенной стадии на чайки вторично наносят полужидкий агар, содержащий антибиотик олеандомицин в концентрации Юмкг/мл для отбора мутантов Oln „ При концентрации НГ 5 мкг/мг число полу- ченных мутантов является максимальным и составляет 10 на 10 выживших клеток (см„ табл«)с

Примеры 2-5о Определение эффективности мутагенов 4-хинолин-1- оксида (НХО), Н-нитрозо-Н-метилмоче- вины (НИМ), динитробензоперилена (5, (5,10-ДНБП) , ДПДТДП-6,7-диамино-4,9- диокси-5,1О-диоксо-4,5,9,10-тетра- гидро-7,9-диаэапирена СЩЩТДП) „

Эксперимент осуществляют также, как в примере 1, но используют мутаген НХО (в концентрации 1 мкг/мл, приводяцей к уровню мутаций 1,5-10), НММ (в концентрации 10 мкг/мл, даю- цей уровень мутаций 2 -10), ДНБП (коцентрация 1 мкг/мл, число мутантов 1-Ю3), ДДЦТДП, который в концентрации 50 мкг/мл приводит к уровню мутаций 5-10 (см. табл.).

Практически при всех используемых дозах мутагенов наблюдают, что выживаемость клеток штамма So aureofacien существенно не снижаетсяо Для мутагенов ДДДТДП, ДНБП, НИМ и НГ выживав мость при оптимальных для получения мутантов дозах мутагена составляет от 30 до 100%. Исключение составляет лиыь мутаген НХО: использование

его в концентрации 1 мкг/мл приводит к снижению выживаемости клеток до 11(Г , а в концентрации 0,5 мкг/мл - до 10%. Существенно, что во всех приведенных примерах абсолютное число мутантов, полученных после обработки мутагенами, значительно выше спонтанного уровня, а также на 2-3 порядка превышает число мутантов, полуненных при соответствующих концентрациях мутагенов по способу- прототипу (см., табл.,)

Пример 6о Определение эффективности этилметансульфоната (ЭМС) для С, acetobutylicum,,

В расплавленный полужидкий агар (0,8%) объемом 2,5 мл при 45°С вносят 100 мкл суспензии спор и мутаген ЭМС в объемах, соответствующих его конечной концентрации 0,6 мг/мл„ Смесь перемешивают, наслаивают на заранее подготовленный нижний слой агара, содержащий в качестве селективного фактора рифампицин (3 мг/мл) и учитывают через 72 ч инкубации в аэростате число устойчивых к рифампицину (Rif ) мутантово Для концентрации этилметансульфоната (0,6 мг/мл) число мутантов равно 185, что в 92,5 раза превышает число мутантов, получаемых при таких же концентрациях мутагена стандартным методом прототипа (см« табл)о

Применение указанного способа позволяет значительно (до 200 раз по сравнению с прототипом) уменьшить дозы мутагенов, используемых при получении различных типов мутаций,, Это приводит к экономии расхода мутагенов и повышению безопасности работы с нимио В свою очередь, низкие дозы мутагена обеспечивают увеличение выживаемости клеток, а следовательно, и абсолютного числа мутаций в популяции, т„ес повышают эффективность мутагенеза „ При этом сокращается число вредных и множественных мутаций„ Способ позволяет быстро и с хорошим выходом (число мутантов в 10-100 раз больше, чем в способе-прототипе) получать мутанты с заданными свойствами бактерий, а также является экспресс-методом для определения эффективности действия различных мутагенов по отноше- няю к актиномицетаМо

Способ может использоваться в. процессе рациональной селекции с целью улучшения технологических свойств промышленных штаммов - продуцентов биологически активных веществ.

Формула изобретения Способ получения мутантов у споро - образуюцих бактерий Streptomyces и Clostridium acetobutylicum, предусматривающий обработку культуры мутагенами с последующим отбором мутантов на селективных средах, о т- личаюцинся тем, что, с целью повышения выхода мутантов с минимальным числом множественных му таций, бактериальную культуру обра

батьшают мутагеном на стадии прорастания спор, а в качестве мутагена используют N-мeтил-N- нитpo-N-нит- розо-гуанидшюм (НГ) в концентрации 5-25 мкг/мл, или 4-нитрохинолин-1- оксидом (11X0) 0,5-1 мкг/мл, или N-нитрозо-М-метилмочевиной (НИМ) 1-50 мкг/мл, или динитробензопериленом (5,10-ДИБП) 1-25 мкг/мл, или ДДЦТДП-2,7-диамино-4,9-диокси-5,10- дноксо-4,5,9,1О-тетрагидро-7,9-ди- азапиреном (ДДДТДП) 5-50 мкг/мл, или этилметансульфонатом (ЭМС) 0,25 9у8 Mr/мл

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получении мутантов промышленных штаммов актиномицетов и анаэроб- нон бактерии Clostridium acetobutyii- L-uia Целью изобретения является повышение выхода мутантов с минимальным числом множественных мутаций при увеличении абсолютного числа мутантов в популяции клеток0 Способ заключается в обработке на стадии прерастания спор бактерий Clostridium aretobuty- 1 irura и бактерий рода Streptomyces низкими концентрациями химических мутагенов, 1 табл0 3 (Л

Частота индуцированных мутантов как показатель эффективности действия различных мутагенов на штамм So aureofaciens

римечание.

Эффективность действия мутагенов учитывают по увеличению числа мутантов Oln , устойчивых к олеандомицину, число спонтанных мутаций Oln - 1 -102 на 10 выживших клеток.