Способ дифференциальной диагностики идиопатической тромбоцитопенической пурпуры и гипопластической анемии Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологи-и, и может быть использовано при диагностике заболеваний крови.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Цель достигается тем, что из крови больного выделяют лимфоциты, отмывают от плазменных факторов, первую порцию лимфоцитов инкубируют с тромбоцитарным антигеном, затем их отмывают от несвязанного антигена и повторно инкубируют с второй порцией отмытых лимфоцитов, и при количестве лимфоцитарных агглютинатов 2:2,5% диагностируют ИТП, а при результате 2,5% диагностируют ГА.

Сущность способа заключается в том, что производят исследование крови больного, при этом: из крови выделяют лимфоциты; лимфоциты отмывают от плазмы.

Тщательная отмывка от плазмы обязательна, так как нами было выявлено, что при данной патологии в плазме больного содержатся факторы, искажающие результаты исследования и снижающие точность способа. В роли таковых могут выступать аутоантите- ла, направленные против тест-антигена, эндогенные токсины, блокирующие факторы и

ДР.

Полученные лимфоциты инкубируют с заранее приготовленным тромбоцитарным антигеном. На этом этапе антиген специфически связывается с мембранами сенсибилизированных лимфоцитов.

о

4 VI

4 О

Лимфоциты отмывают от несвязанного антигена, чтобы исключить его участие в дальнейшем процессе.

Полученные лимфоциты повторно инкубируют с новой порцией отмытых от плазмы лимфоцитов того же больного. При этом сенсибилизированные лимфоциты новой порции через антигенный мостик связываются с ранее инкубированными лимфоцитами, образуя агглютинаты.

Результат исследуют под микроскопом, подсчитывая процентное отношение агглю- тйнатов к свободно лежащим лимфоцитам. При количество лимфоцитарных агглютина- тов равном и более 2,5% ставится диагноз ИТП, а при результате менее 2,5% диагностируют ГА.

Приготовление антигена из тромбоцитов человека.

Берут из локтевой вены 10-12 мл донорской крови, на гепариновый раствор (по 25 ед.гепарина на 1 мл крови). Центрифугированием (10 мин при 1500 об/мин) осаждают лейкоциты и эритроциты. Надосам- ную жидкость, .которая содержит тромбоциты, nepei юсят в другую силиконированную пробирку и отмывают физиологическим раствором (0,85%) три раза с помощью центрифугирования (при 3000 об/мин, 20 мин). Затем подсчитывают число тромбоцитов общепринятым способом, делают мазок из осадка тромбоцитов, высушивают его, окрашивают по Романовскому-Гимзе и мик- роскопируют (90x10) общепринятым способом. При этом определяют а нем наличие тромбоцитов.

8 o i дельных случаях в мазке обнаруживаются не только тромбоциты, но и эритроциты и лейкоциты донора, В этих случаях проводят дополнительную очистку тромбоцитов. Для этого осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и центрифугируют в пробирке (при 1000 об/мин, 5 мин), Затем надосадок, содержащий тромбоциты, переносят в другую пробирку и вновь центрифугируют (при 3000 об/мин, 20 мин). Надосадок удал я ют, а осадок, состоящий из тромбоцитов, разводят в 2 мл физиологического раствора и разрушают при помощи последовательного замораживания в морозильнике бытового холодильника и размораживания с подогревом до 40°С в теплой воде 3-4 раза.

После этого концентрацию бэлка в антигене из тромбоцитов доводят до рабочей концентрации 280 мкг/мл. Антиген разливают по 0.5 мл в стерильные ампулы, их запаивают, замораживают и сохраняют в морозильнике ытоаого холодильника при 4°С. Антиген, приготовленный указанным

способом, пригоден в течение 2-2,5 мес. Работа ведется в асептических условиях.

Выделение лимфоцитов проводят общепринятым способом. 2 мл крови больного, взятой на гепариновый раствор (25 ед.гепарина на 1 мл крови), разводят в соотношении 1:2 средой 199. Осторожно наносят кровь на раствор фиколла (3 мл) с плотностью 1,077 г-мл в центрифужную

пробирку и центрифугируют при 1500 об/мин 30 мин. После центрифугирования клетки крови разделяются на две фракции: белый слой, состоящий из лимфоцитов, располагается на поверхности фиколла, а эритроциты

и гранулоциты - на дне пробирки.

Лимфоциты собирают пастеровской пипеткой в коническую пробирку и отмывают три раза средой 199 с центрифугированием при 800 об/мин 5 мин. Подсчет лимфоцитов

проводят в камере Горяева общепринятым способом и доводят их концентрацию до 2 106 клеток в 1 мл. .

Регистрация антигенсвязывающих лимфоцитов в крови больных.

В опытной пробе к 0,1 мл лимфоцитов добавляют 0,1 мл антигена из тромбоцитов, встряхивают и инкубируют 30 мин при 37°С. После инкубации проводят отмывку лимфоцитов от лишнего несвязанного антигена в

среде 199 путем центрифугирования в течение 5 мин при 800 об/мин.

К отмытым от антигена клеткам добавляют вторую порцию лимфоцитов (0,1 мл), смесь встряхивают, центрифугируют 5 мин

при 800 об/мин. Инкубируют 30 мин при 37°С. В контрольную пробу вместо антигена добавляют равное количество среды 199. Из осадка готовят мазки, которые быстро высушивают и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Мазки микроскопируют, подсчитывая в них 200 лимфоцитов, отмечая среди них агглютинаты, состоящие из 2-3 лимфоцитов, которые представляют собой антигенсвязывающие клетки, Число агглютинированных лимфоцитов выражают в % к общему числу подсчитанных лимфоцитов. Результат выражают разностью между опытной и контрольной пробами.

П р и м е р 1. Приводят примеры клинического применения способа. Типичная форма ИТП. Больная Л., 23 г. поступила в клинику с жалобами на кровоподтеки под кожу конечностей, десневое кровотечение. Направительный диагноз: ИТП. Болеет в

течение 3 лет, неоднократно лечилась ie- мостатическими препаратами и кортикосте- роидами, но кровь и ее компоненты не переливались. Анализ крови: НВ-106 г/л, эритроциты 4,85 1012 кл/л, лейкоциты

6,5 -10 кл/л, лимфоциты 20%, тромбоциты 4,3 109 кл/л. При исследовании костного мозга последний богат клеточными элементами, лимфоцитов 5,2%, множество мегака- риоцитов (в двух препаратах подсчитано 20 мегакариоцитов, из них 12 не функционирует, 8 функционирует слабо). Содержание ан- тигенсвязывающих лимфоцитов составило 6%, чем подтвержден направительный диагноз: итп.

Проведено консервативное лечение с последующей операцией - спленэктомией. Состояние больной быстро улучшилось (кровоподтеки полностью рассосались, увеличилось количество тромбоцитов - 466,0 109кл/л, лейкоцитов 12,3 109кл/л.

П р и м е р 2. Атипичная форма ИТП. Больная К., 14 лет, госпитализирована с направительным диагнозом: ГА. Жалобы при поступлении на носовое, маточное и десне- вое кровотечение. В течение двух лет безуспешно лечилась трансфузиями крови и ее компонентами. Объективно: состояние больной при поступлении тяжелое, кожные покровы бледны, множественные кровоподтеки по всему телу разного размера и давности, регионарные лимфоузлы не увеличены. Пульс слабого наполнения и напряжения, учащен до 108 уд/мин, артериальное давление 100/60 мм рт.ст. Анализ крови- гемоглобин40г/л, эритроциты 2,0 10 2кл/л, тромбоциты 16,0 109 кл/л, лейкоциты 3,7 10 кл/л, лимфоциты 45% На основании клинике - гематологических данных больной был поставлен предварительный диагноз: гипопластическая анемия. Но, поскольку количество антигенсвязывающих лимфоцитов, определенное предлагаемым способом, составило 7%, был поставлен другой диагноз: хроническая рецидивирующая форма идиопатической тромбо- цитопенической пурпуры, осложнение - постгеморрагическая анемия,

Было назначено соответствующее лечение, состояние улучшилось, кровоподтеки рассосались, увеличилось количество гемоглобина до 100 г/л, эритроцитов до 3,5 1012 кл/л, лейкоцитов до 7,8 109 кл/л, снизилось содержание лимфоцитов до 31 %, увеличилось количество тромбоцитов 38,6 10 кл/л. Последующее наблюдение и данные миелограммы подтвердили правильность нашего диагноза. Миелограмма: костный мозг многоклеточен, красный poo- ток раздражен, лимфоциты 17%, множество мегакариоцитов (из 14 подсчитанных функционируют 2).

П р и м е р 3. Типичная форма ГА. Больной М , 10 лит поступил в клинику о жалобами на слабость, носовое кровотечение, множественные кровоподтеки, шум в ушах

и затемнение перед глазами. Направительный диагноз: ГА. В течение года многократно лечился в различных лечебных учреждениях с малым клиническим эффектом. Объективно:состояние больного

тяжелое, кожные покровы бледные, множественные кровоподтеки, носсзое и де- сневое кровотечения. Анализ коови: гемоглобин 60 г/л, эритроциты 1,8 10 кл/л, лейкоциты 1,15 10. кл/л. лимфоциты 75%,

тромбоциты 2,24 10 кл/л. Миелограмма: костный мозг малоклеточен, повышено содержание лимфоцитов 43,8%. В двух препаратах костного мозга найден всего один мегакариоцит, и тот не функционирует. Содержание антигенсвязывающих лимфоцитов по предлагаемому способу 1,5%, что подтверждает направительный диагноз - гипопластическая анемия.

После проведения целенаправленного

консервативного лечения многократным переливанием крови стойкого улучшения кли- нико-гематологических показателей не наступило (кровоподтеки не рассосались, сселось сниженным содержание гемоглобина 70 г/л, эритроцитов 2,0 1012 кл/л, а лимфоцитов повышенным 63%). Учитывая малоэффективность консервативного лечения больному проведено оперативное лечение - пересадкаеллогенного костного мозга

от родственника, после чего наступило улучшение

П р и м е р 4. Атипичная форма ГА. Больной Р., 13 лет, поступил в клинику с направительным диагнозом: ИТП. Жалобы

при поступлении на носовое кровотечение и кровоподтеки, общую слабость. Объективно: состояние средней тяжести, кровоподтеки под кожу нижних конечностей и предплечий, незначительное носовое кровотечение. Анализ крови гемоглобин 82 г/л, эритроциты 3,1 -101 кл/л, лейкоциты 4,3 10 кл/л, лимфоциты 32%, тромбоциты 34,6 109 кл/л. Содержание антигенсвчзы- вающих лимфоцитов 1 %, на основании чего

диагноз И ГП изменен на ГА. После адекватной терапии исследована миелсн рамма: костный мозг умеренно клеточен, повышено содержание лимфоцитов 39%, мегакариоцитов мало, (в двух препаратах найдени всего 4 мегакариоцита, из них функционирует только один). Анализ крови после лечения: гемоглобин 95 г/л, эритроциты 3.5 1012 кл/л, лейкоциты 3,7 1GJ кл/л, лимфоциты 66%, тромбоциты 92,3 10° кл/л, Наступило

клииичес.кое состояние и о дальнейшем было произведено оперативное печение - спленэктомия.

П р и м е р 5. Здоровый донор костного мозга И., 27 лет, ближайшее время ничем не болел. Анализ крови: гемоглобин 134 г/л, эритроциты 4,3 1012 кл/л, лейкоциты 7,6 -10 кл/л,лимфоциты24%,тромбоциты 286,0 10 кл/л. Миелограмма; костный мозг богат ядросодержащими элементами, лимфоцитов 14,8%, мегакариоцитов много (в двух препаратах 14 мегакариоцитов, из них 12 функционирующие), Антигенсвязы- вающих лимфоцитов по предлагаемому способу 1,2%.

Выполнение дифференциальной диагностики ИТП и ГА предлагаемым способом, по сравнению с известными, обеспечивает;

ускорение диагностического исследования в 2-3 раза по сравнению с прототипом (2,5-3 ч против 6-8 ч);

дифференциальную диагностику ИТП и ГА по анализу крови;

снижение травматичности исследова- ния/io сравнению со способами диагностики по костному мозгу;

повышение точности диагностики ИТП и ГА и особенно их атипичных форм;

сокращение объема крови и ее компонентов, затрачиваемых на безрезультатное лечение при ошибочном диагнозе;

вследствие перечисленного становится возможной экономия затрат на диагностику и лечение больных ИТП и ГА.

При атипичных формах ИТП и ГА точность диагностики повышается до 89- 93%.

Формула.изобретения

Способ дифференциальной диагностики идиопатической тромбоцитопенической пурпуры и гипопластической анемии путем исследования клеток крови, отличающ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, из крови выделяют лимфоциты, часть из которых инкубируют с тромбоцитарным антигеном с конечной концентрацией белка 140 мкг/мл в течение

30 мин при 37°С, отмывают и соединяют с равным объемом другой части нативных лимфоцитов, далее готовят мазки, окрашивают их, подсчитывают процентное содержание агглютинированных лимфоцитов,

сравнивают с контролем, не содержащим тромбоцитарного антигена, определяют разность показателей и при ее величине, равной и более 2,5%, диагностируют идио- патическую тромбоцитопеническую

пурпуру, а при величине менее 2,5% диагностируют гипопластическую анемию.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при дифференциальной диагностике заболеваний крови, особенно из атипичных форм. Цель - повышение точности диагностики. Иммунологический способ основан на специфической реакции взаимодействия сенсибилизированных антигенсвязывающих лимфоцитов больного с тромбоцитарным антигеном, включающий выделение из крови больного лимфоцитов, их отмывку от плазменных факторов, инкубацию первой порции лимфоцитов с тромбоцитарным антигеном, от- мывку лимфоцитов от несвязанного антигена и последующую инкубацию с второй порцией отмытых лимфоцитов. При количестве лимфоцитарных агглютинатов, равном и более 2,5% относительно контроля, диагностируют идиопатическуютромбо- цитопеническую пурпуру (ИТП), а при результате менее 2,5% - гипопластическую анемию (ГА). При атипичных формах ИТП и ГА точность диагностики повышается до 89 -93%. (Л С