СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИМФОТОКСИЧНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ В РЕАКЦИИ СПОНТАННОГО Е-РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, конкретно к лабораторной диагностике иммунологическими методами.

Предлагаемый способ определения лимфотоксичности лекарственных препаратов в реакции спонтанного E-розеткообразования может быть использован в гематологии, токсикологии и других разделах медицины для тестирования на конкретного больного.

В известном способе определения токсичности физико-химических воздействий полученные результаты экстраполировались на организм в целом по уменьшению диаметра клеточного ядра буккального эпителия более чем на 45% после физико-химических воздействий на него (Кожин А.А. и Корниенко Г.Г.: БИ, 1997, N 4, 930192873).

Федюкович Л. В. с соавт. (БИ, 1997, N 4, патент 2073244) определяли мембранотоксические свойства ксенобиотиков в реакции спонтанного розеткообразования у лабораторных животных через 24 ч после внутрибрюшинного введения им тестируемого ксенобиотика по увеличению числа розеткообразующих клеток.

Отсутствуют способы определения токсического воздействия лекарственных веществ на конкретную точку приложения в организме человека, что необходимо например, у гематологических больных, когда важен генез развившегося заболевания с реакцией клеток крови, не подвергая больного патологическому воздействию лекарственных препаратов. Также отсутствуют способы, позволяющие осуществить индивидуальный выбор лекарственных препаратов для проведения терапии, исключив возможность развития патологических реакций у конкретного больного.

Цель изобретения - разработка информативного и простого способа определения токсичности действия лекарственных веществ на модели лимфоцитов больного, что имеет исключительно важное значение при дифференциальной диагностике токсических и аутоиммунных состояний в клинической практике, а также при выборе спектра лекарственных препаратов для успешного лечения конкретных больных, исключая возможность развития побочных эффектов терапии.

Определение лимфотоксичности лекарственных препаратов проводилось в лимфоцитарной взвеси, выделенной из гепаринизированной крови больного с помощью центрифугирования ее на градиенте с плотностью 1,077, в качестве которого использовали фикол-верографиновый буфер. Проводились реакция E-розеткообразования с эритроцитами барана в присутствии испытуемого лекарственного препарата, с которым лимфоциты инкубировались, а также реакция спонтанного E-розеткообразования без препарата, результат которой принимался за контрольный параметр, сравнение с ним позволяло получать информацию о влиянии лекарственного препарата на подвижность поверхностных E-рецепторов лимфоцитов.

Индекс чувствительности лимфоцитов к тестируемому препарату принимался за индекс лимфотоксичности препарата и вычислялся по формуле

Значение ИЛТ < 1,0 свидетельствовало об угнетении подвижности E-рецепторов лимфоцитов тестируемым препаратом, выражающейся в угнетении реакции розеткообразования при добавлении к взвеси лимфоцитов лекарственного препарата, т.е. о его токсическом воздействии.

Значение ИЛТ ≥ 1,0 свидетельствовало об отсутствии лимфотоксического эффекта тестируемого лекарственного препарата.

Клинические примеры:
1. Кузнецов Артем, история болезни N 8649.

В возрасте 1 год 2 месяца 17.11.96 г. был госпитализирован в 1 онкогематологическое отделение областной детской клинической больницы N 1 с диагнозом: гетероиммунный агранулоцитоз токсического генеза, трехростковая панцитопения.

С 5.11.96 г. перенес краснуху с гипертермией, получал при этом панадол и аспирин (известно, что отец ребенка на прием аспирина реагировал носовыми кровотечениями). 15.11.96 г. после легкого ушиба слизистой полости рта развилось обильное, длительно не купировавшееся кровотечение. При обследовании в городской детской больнице 15 г. Екатеринбурга в общем анализе крови в это время отмечался агранулоцитоз, анемия и тромбоцитопения. При установке подключичного катетера возникло кровотечение из места вкола, купировавшееся после введения ε-аминокапроновой кислоты и трансфузий эритроцитарной взвеси, криопреципитана, а также свежезамороженной плазмы.

При госпитализации в онкогематологическое отделение ОДКБ N 1 состояние тяжелое, на коже множественные петехии, гематомы в местах инъекций, спленомегалия - селезенка выступала из-под края реберной дуги на 2 см. В общем анализе крови - эритроцитов 3,55 • 10¹²/л, гемоглобин - 87 г/л, ретикулоцитов - 0,3%, тромбоциты - единичные, лейкоцитов - 1,7 • 10⁹, бластов - 4%, лимфоцитов - 45%, моноцитов - 1%, СОЭ - 27 мм/час. Был заподозрен острый лейкоз.

В пунктате костного мозга из грудины 18.11.96 г. : бластов 22,8% (миеломонобласты), лимфоцитов - 71%, мегакариоциты не обнаружены, клеточность умеренная.

19.11.96 г. в пунутате костного мозга из подвздошной кости : клеточность умеренная, бластов - 8,6%, лимфоцитов - 31,6%, эритроцитарный росток восстановился - 30,4% (признаки дизэритропоэза), гранулоцитарный росток оставался суженным - 28,2%, индекс созревания - 0,6, мегакариоциты не обнаружены, тромбоциты - единичные.

В гемостазиограмме: признаки глубокой тромбоцитопении и структурно-хронометрической гипокоагуляции.

При ультразвуковом исследовании органов брюшной полости: гепатомегалия с увеличением правой (105 мм) и левой доли (62 мм), признаки нефрита, токсического генеза - уплотнение паренхимы обеих почек.

При электрокардиографическом исследовании: тахикардия с частотой сердечных сокращений 152-172 удара в минуту.

Из зева высевались Haemophillis influenza и Staphylococcus haemolyticus et epidermalis.

Проведены тесты определения лимфотоксичности препаратов, которые получал ребенок в период, предшествующий заболеванию, получены следующие значения индекса лимфотоксичности: ИЛТ гентамицина = 0,85, аспирина - 0 с гемолизом лимфоцитов больного, анальгина - 0,77, калпола - 0,88, панадола - 0,83, бисептола - 0,44.

Состояние расценено как гетероиммунная панцитопения с поражением клеток-предшественников миелопоэза, вызванная приемом аспирина, токсический эффект которого был поддержан приемом других лекарственных препаратов, примененных в комплексе с ним на фоне инфекций.

26.11.96 г. в пунктате костного мозга из грудины: клеточность умеренная, полностью восстановлен эритроидный и мегакариоцитарный ростки, сохранялось угнетение гранулоцитарного роста - 5,2%, его омоложение - индекс - 1,4.

В связи с указанным был назначен курс преднизолона per os из расчета 2 мг/кг в сутки.

Через 3 месяца показатели гемограммы восстановились, повторно проведены тесты определения лимфотоксичности препаратов: ИЛТ аспирина = 0,28, панадола - 1,0, анальгина - 0,62, септрина - 0,98, димедрола - 0,76, бисептола - 0,44, стрептоцида 0,88, цефабита - 0,78, фортума - 0,88, амикофера - 1,24.

Таким образом, после исключения препаратов, оказывающих ранее лимфотоксическое действие, и проведения курса кортикостероидной терапии, уменьшилось лимфотоксическое действие ряда препаратов, наибольший отрицательный эффект сохраняется у аспирина, который было рекомендовано исключить пожизненно. Кроме того, определены препараты, не оказывающие отрицательного воздействия на лимфоциты больного, что может быть экстраполировано на организм в целом.

Разработанные тесты помогли определить генез развившегося тяжелого гематологического синдрома, определить тактику его купирования и спектр препаратов, применение которых возможно при последующих заболеваниях без риска развития тяжелых гематотоксических осложнений.

2. Аксенова Настя, 11 месяцев, 17.12.96 г. была направлена лечащим врачом по месту жительства на амбулаторный прием к гематологу ОДКБ N 1. В течение 5 дней держалась высокая гипертермия, жидкий стул, катаральные явления - признаки ринофарингита после контакта с больным ОРВИ в семье. В течение 4 дней мама самостоятельно давала ребенку антигриппин в дозе взрослого человека - по 1 таблетке 4 раза в день, анальгин по 0,5 от 1 до 3 раз в день, периодически аспирин по 0,25. Девочка находилась на естественном вскармливании и с материнским молоком дополнительно к названному получала лекарственные препараты, которые принимала мама: антигриппин по 6 таблеток в сутки, анальгин по 0,5-3 раза в день и аспирин по 0,5-4 раза в день. Бригада скорой медицинской помощи однократно с литической целью ввела ребенку внутримышечно 0,1 мл 50% раствора анальгина и 0,1 мл 1% раствора димедрола. Температура не снижалась и девочка была госпитализирована в детскую городскую больницу N 11, где получала супрастин, ампициллин и курантил в возрастных дозах, при этом мама самостоятельно давала ребенку периодически парацетамол по 1 таблетке, а сама продолжала принимать антигриппин и анальгин, продолжая кормить грудью.

15.12.96 г. в общем анализе крови признаки агранулоцитоза: лейкоцитов - 11,0 • 10⁹/л, базофилов - 2%, эозинофилов - 4%, нейтрофилов палочкоядерных - 1%, сегментноядерных - 5%, лимфоцитов - 76%, моноцитов - 12%.

17.12.96 г. в пунктате костного мозга представлены все ростки кроветворения, бластных клеток - 4,8%, признаки раздражения гранулоцитарного ростка кроветворения - клеточный состав расширен, присутствуют юные формы, миелоциты и промиелоциты.

В анализе периферической крови - токсическая зернистость нейтрофилов.

Проведены тесты определения лимфотоксичности препаратов: ИЛТ аспирина = 0, курантила - 0,17, супрастина - 0,17, антигриппина - 0,67, парацетамола - 0,77, анальгина - 0,87, ампициллина - 0,83.

По результатам обследования поставлен диагноз: гетероиммунный агранулоцитоз токсического генеза. Отменены все названные препараты. Определен терапевтический комплекс: преднизолон внутривенно струйно по 15 мг N 5, инфузионная терапия в объеме 200,0 мл физиологическим раствором и гемодезом, гентамицин парентерально, аскорутин и лактобактерин per os.

Клинические и лабораторные параметры восстановились через 12 дней.

В общем анализе периферической крови 29.12.96 г.: лейкоцитов - 8,0 • 10⁹/л, базофилов 1%, эозинофилов 4%, нейтрофилов палочкоядерных - 8%, сегментноядерных - 11%, лимфоцитов - 68%, моноцитов - 10%, плазматических клеток - 1:100, нормобластов - 1:100.

Через 2 месяца при контроле периферической крови в общем анализе крови: лейкоцитов - 5,5 • 10⁹/л, базофилов - 1%, эозинофилов - 3%, нейтрофилов палочкоядерных - 7%, сегментноядерных - 11%, лимфоцитов - 62%, моноцитов - 6%.

В данном случае тесты лимфотоксичности помогли установить диагноз заболевания, исключить причинно-значимые факторы из терапевтического комплекса, определить лечебную тактику, проведение которой привело к быстрому купированию патологического процесса.

Изобретение может быть использовано в медицине, а именно в лабораторной диагностике иммунологическими методами, а также в гематологии, токсикологии и других разделах медицины для тестирования лекарственных препаратов на наличие у них токсического эффекта при воздействии на конкретного больного. Определение лимфотоксичности лекарственных препаратов проводят в лимфоцитарной взвеси, выделенной из гепаринизированной крови больного с помощью центрифугирования ее на градиенте с плотностью 1,077. Инкубация выделенной из крови лимфоцитарной взвеси используется в течение 90 мин с тестируемым на наличие токсических свойств лекарственным препаратом, а затем после двухминутного центрифугирования инкубация продолжается с эритроцитами барана в течение 18 ч, после которой вычисляется индекс чувствительности лимфоцитов к тестируемому препарату, принимаемый за индекс лимфотоксичности препарата, по формуле и при значении ИЛТ< 1,0 делают вывод об угнетении подвижности Е-рецепторов лимфоцитов, а при ИЛТ ≥ 1,0 - об отсутствии лимфотоксического эффекта. Способ более точен, прост, информативен, позволяет проводить дифференциальную диагностику токсических и аутоимунных состояний.

Способ определения лимфотоксичности лекарственных препаратов в реакции спонтанного E-розеткообразования лимфоцитов больного, отличающийся тем, что используется инкубация выделенной из крови лимфоцитарной взвеси в течение 90 мин с тестируемым на наличие токсических свойств лекарственным препаратом, а затем после двухминутного центрифугирования инкубация продолжается с эритроцитами барана в течение 18 ч, после которой вычисляется индекс чувствительности лимфоцитов к тестируемому препарату, принимаемый за индекс лимфотоксичности препарата по формуле

и при значении ИЛТ < 1,0 делается вывод об угнетении подвижности E-рецепторов лимфоцитов тестируемым препаратом, выражающейся в угнетении реакции розеткообразования при добавлении к взвеси лимфоцитов лекарственного препарата, т. е. о его токсическом воздействии, а при значении ИЛТ ≥ 1,0 - об отсутствии лимфотоксического эффекта тестируемого лекарственного препарата.