Способ получения эритропоэтина Советский патент 1991 года по МПК A61K37/24 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению гормональных препаратов.

Целью изобретения является повышение выхода эритропоэтина.

Пример1.У овцы, зараженной анаплазмами (Anaplasma ovis) в период острого течения болезни, когда количество эритроцитов, пораженных анаплазмами составило 5- 10%, используют кровь для заражения овец, свободных от кровепаразитов,

Опытному предварительно спленэктоми- рованному животному вводят внутрибрю- шинно 20 мл инфицированной крови сразу же после ее отбора. Непосредственно перед заражением число эритроцитов у опытного животного составляет 9,8 млн/мкл, количество гемоглобина и уровень эритропоэтина 153 г/л и 0,03 ЕД/мл соответственно.

Через 15 дней после заражения берут пробы крови и определяют число эритроцитов, количество гемоглобина и уровень эритропоэтина, которые характеризуются следующими показателями число эритроцитов 3,9 млн-мкл; количество гемоглобина 43 г/л; уровень эритропоэтина 0,3 ЕД/мл.

В течение последующих 4 дней контролируют соответствующие показатели, которые на 19 день после заражения составили: число эритроцитов 1,55 млн/мкл; количество гемоглобина 16,3 г/л; уровень эритропоэтина 1,5 ЕД/мл, т.е. при падении количества гемоглобина до 16,3 г/л уровень эритропоэтина увеличился до 1,5 ЕД/мл по сравнению с 0,03 ЕД/мл до опыта

Пример 2. У опытного животного. свободного от кровепаразитов и предварительно спленэктомированного, определяли общее состояние, окраску видимых слизистых оболочек и конъюктивы, температуру, пульс, состояние сердечной деятельности, число эритроцитов, количество гемоглобина и уровень эритропоэтина, последние показатели контролируют в течени б дней,начиная с 12 дня после заражения

Ё

О

ел

ю о ю

Перед заражением число эритроцитов составило 8,8 млн/мкл, количество гемоглобина и уровень эритропоэтина 153 г/л и 0,04 ЕД/мл соответственно.

Инфицированную кровь, полученную от барана, больного анаплазмозом, в дозе 40 мл сразу же вводили внутрибрюшинно опытному животному.

На 18 день после заражения показатели крови следующие: число эритроцитов 1,5 млн/мкл; количетвогемоглобина 1бг/л;. уровень эритропоэтина 1,5 ЕД/мл.

П р и м е р 3. На группе овец, свободных от кровепаразитов и предварительно спленэк- томированных, изучена динамика изменения показателей крови в зависимости от продолжительности периода после заражения.

Всех животных заразили внутрибрюшинно введением 40 мл крови, полученной от больного анаплазмозом барана. Основные показатели крови - количество эритроцитов, гемоглобина и уровень эритропоэтина определяли до заражения, через 12, 15, 18 и 19 дней после заражения.

Результаты представлены в таблице. Как видно из данных таблицы, на 18-19 день отмечалось резкое падение количества гемоглобина при одновременном повышении уровня эритропоэтина.

При падении концентрации гемоглобина до значения ниже 19,0 г/л животных обескровливали, из полученной крови после центрифугирования при 3000 об/мин, в течение 30 мин отделяли плазму, которая в Замороженном виде может храниться длительный срок (при температуре -20°С в течение 4-6 мес.).

Для определения эритропоэтической активности использовали полицитемических Постгипоксических мышей-самок линии FI (CBAxCST) B1. Полицитемию вызывали содержанием животных в барокамере при давлении 0,45 атм по 18-20 ч в сутки в течение 14-16 сут. Перед началом гипоксии мышам вводили внутримышечно 2 мг препарата железа Феррум-Лек. На 4-5 сут после прекращения гипоксического воздействия вводили подкожно по 1 мл испытуемой сыворотки (плазмы) на 6 день - 18,5кБК(0,4 мл) раствора цитрата железа, меченного Fe в хвостовую вену. Эритропоэтическую активность плазмы оценивали через 48 ч по включению Fe в эритроциты по числу ретикулоцитов, которые подсчитывали в сухих мазках, окра- шенных бриллиант-крезил-блау. Для подсвета включения 5 Fe в эритроциты брали 0,5 мл крови. Подсчет производили на гамма-счетчике фирмы Л КБ (Швеция). В качест- ве стандарта использовали две пробы (0,4 мл с активностью 18,5 кБК) с раствором цитрата железа, меченного 59Fe. Процент включения Fe в эритроциты рассчитывали по формуле число имп./проба х 7 х масса мыши х

59

Fe --

число имп.стандарта

где число имп./проба - импульсы в минуту в 0,5 мл крови; 7 - объем крови у полицитемических мышей.

Активность эритропоэтина в испытуемой пробе перессчитывали в мЕд по доз-реакционной кривой, построенной по лабораторному стандарту эритропоэтина, эритропоэтина для данной линии мышей.

Воспроизводимость результатов в эксперименте контроливалась введением физиологического раствора и определенной дозы (0,4 ЕД) стандартного препарата эритропоэтина.

Таким образом, предлагаемый способ1 открывает дешевый, доступный источник

сырья. Преимуществом эритропоэтической активности является то, что не содержит токсических соединений, а выделенный из нее эритропоэтин может быть использован при культивировани клеток без высокой степени очистки, т.е. примеси плазменных белков не оказывают отрицательного действия в результате добавления цельной сыворотки в качестве питательной среды.

Формула изобретения

Способ получения эритропоэтина, включающий введение индуктора образования эритропоэтина, овцам с последующим отбором крови, отличающийся тем, что, с

целью повышения выхода эритропоэтина, в качестве индуктора образования эритропоэтина используют кровь овец, зараженных анаплазмами, а отбор крови осуществляют после снижения концентрации гемоглобина

0 до значения 19,0 г/л.

Динамика изменения показателей крови

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению гормональных препаратов. Целью изобретения является повышение выхода эритропоэтина. Поставленная цель достигается тем, что в качестве стимулятора образования эритропоэтина используется кровь животных, зараженных анаплазмами. При падении концентрации гемоглобина ниже 19,02 г/л после стимуляции у животных отбирают кровь, выделяют плазму, содержащую высокую концентрацию эритропоэтина. Полученный препарат не требует очистки и может быть использован при культивировании клеток и для получения эритропоэтина.1 табл.