СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 1994 года по МПК A61K39/12 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к способам получения вируса лейкоза крупного рогатого скота из вируспродуцирующей культуры - линии клетки почки эмбриона овцы, хронически инфицированной вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС) для серологической диагностики болезни в реакции иммунодиффузии в агаровом геле со специфической контрольной системой на ВЛ КРС.

Известен способ получения антигена ВЛ КРС.

Однако указанный способ отличается сложным, многооперационным концентрированием, заключающимся в многократном центрифугировании и ресуспендировании. Кроме того, технология предполагает использование первичной культуры: суспензии эксплантантов эмбриона коров, что является очень дорогим сырьем для получения антигена, так как необходимы постоянные поставки свежих эмбрионов. При этом невысока специфическая активность получаемого антигена 1: 8, и только в отдельных экспериментах получен титр 1:32. Постоянные поставки свежих эмбрионов от абсолютно здорового стада (что является обязательным условием) делают практически невозможным промышленное освоение технологии.

Известен способ получения антигена ВЛ КРС. Однако он не дает высоких результатов по специфической активности ( max - 1:16). Кроме того, указанная технология является аппаратоемкой, многооперационной и направлена на выявление только антител внутреннего полипептида (р24) и не выявляет антител оболочечного гликопротеида (др.51). Указанная технология предусматривает использование для получения антигена ростовую среду и клеточный монослой, что исключает перевивку культуры и многократное ее использование и требует дополнительных аппаратных затрат, причем выделение антигена достигается многократным (3-4 раза) ресуспендированием и центрифугированием.

Наиболее близкий из известных способ является сложным, многооперационным, включает культивирование вируспродуцирующих клеток со сменой ростовой среды на поддерживающую, концентрирование ведется с ультрафильтрацией, длительным (1-4 ч) градиентным центрифугированием и ресуспендированием, что не приводит к высоким результатам по специфической активности. Этот способ получения антигена ставит своей целью повышение специфической активности при иммуноферментном анализе, который может быть осуществлен при использовании уникального оборудования. Исследования по ИФА на сегодняшний день невозможно осуществить в областных, а тем более районных лабораториях.

Предлагаемый способ получения антигена вируса лейкоза КРС заключается в культивировании вируспродуцирующих клеток на ростовой среде, содержащей среду Игла, ФГМС, сыворотку крови лошадей или северных оленей, витаминно-солевые добавки при следующем соотношении компонентов, г/л: Натрий фосфорно- кислый одно- замещенный двухводный 0,27-0,81 Калий хло- ристый 0,045-0,135 Магний серно- кислый семи- водный 0,18-0,72 Кальций хло- ристый 0,00009-0,000207 Натрий угле- кислый 0,0009-0,0036 Глюкоза 0,18-0,63 Тиамина хлорид 0,00000018-0,00000072 Рибофлавин 0,00000018-0,00000072 Пантотенат кальция 0,00000018-0,00000072 Пиридоксин 0,00000018-0,00000072
Фолиевая кислота 0,00000018-0,00000072 Никотинамид 0,00000018-0,00000072 Изоинозит 0,00000018-0,00000072 L-глютамин 0,00008-0,0003 Натрий хлористый 2,79-3,15 Холинхлорид 0,00000018-0,00000072 Фенол-рот 0,00000018-0,00000072 Сухой фермен-
тативный гидро-
лизат мышеч- ных белков 443,00-448,00 Сыворотка крови ло- шадей или северных оленей 85,0-95,0 Среда Игла Остальное
Культивирование проводится в аппарате типа "Гироген".

Предлагаемый способ соответствует критерию "Новизна", так как среди источников, общедоступных в нашей стране и за рубежом, не было обнаружено способа получения антигена с такой же совокупностью признаков.

Предлагаемый способ соответствует критерию "Изобретательский уровень", так как его решение не вытекает явным образом из уровня техники. Известные способы получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота обладают другими совокупностями признаков, не приводящими к высоким качественным результатам. При сравнении предлагаемой технологии с известным способом можно сказать следующее. Предлагаемая работа не ставила своей задачей получение антигена для использования его в ИФА, как чисто лабораторного и неиспользуемого в сельскохозяйственном производстве. Антиген, дающий высокую специфическую активность в РИД, может быть использован в любых условиях, а при проведении дополнительной очистки, имеющей место в известном способе, предлагаемый антиген дает хорошие результаты в ИФА (1:80 - 1:160).

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Перевиваемую линию клеток, продуцирующую вирус лейкоза КРС, культивируют на питательной среде, состоящей из среды Игла, ФГМС, витаминно-солевыми добавками и сывороткой крови животных при следующем соотношении компонентов, г/л: Натрий фосфорно- кислый одно- замещенный двухводный 0,27-0,81 Калий хло- ристый 0,045-0,135 Магний серно-кис- лый семи- водный 0,18-0,72 Кальций хло- ристый 0,00009-0,000207 Натрий уг- лекислый 0,0009-0,0036 Глюкоза 0,18-0,63 Тиамина хлорид 0,00000018-0,00000072 Рибофлавин 0,00000018-0,00000072 Пантотенат кальция 0,00000018-0,00000072 Пиридоксин 0,00000018-0,00000072 Фолиевая кислота 0,00000018-0,00000072 Никотинамид 0,00000018-0,00000072 Изоинозит 0,00000018-0,00000072 L-глютамин 0,00008-0,0003 Натрий хлористый 2,79-3,15 Холин- хлорид 0,00000018-0,00000072 Фенол-рот 0,00000018-0,00000072 Сухой фермен- тативный гидро- лизат мышеч- ных белков 443,00-448,00 Сыворотка крови лошадей или северных оленей 85,0-95,0 Среда Игла Остальное
Клеточные культуры выращивают при 37^оС в течение 3-7 сут без смены среды в аппарате типа "Гироген". При формировании клеточного монослоя культуральную жидкость сливают и используют для получения антигена. Часть клеток снимают со стекла обычным методом и используют для перевивки на новый цикл наработки антигена. Перевивку культуры осуществляют до 30-50 пассажей. Полученную культуральную жидкость осветляют фильтрованием. В дальнейшем концентрирование осуществляется ультрафильтрацией с пределом 15000 Д. Концентрат ресуспендируют фосфорно-буферным раствором и лиофилизируют. Примеры конкретного исполнения и результаты экспериментов приведены в таблице.

Таким образом, предложена простая, неаппаратоемкая технология получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота, которая позволяет получить антиген с высокой специфической активностью и возможностью широко использовать его в условиях с/х производства.

Использование: ветеринарная вирусология, а именно способ получения вируса лейкоза крупного рогатого скота. Сущность изобретения: способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота заключается в культивировании вируспродуцирующих клеток на ростовой среде, содержащей среду игла, ФГМС, сыворотку крови лошадей или северных оленей, витаминно-солевые добавки при следующем соотношении компонентов, г/л: натрий фосфорно-кислый однозамещенный двухводный 0,27 - 0,81; калий хлористый 0,045 - 0,135; магний сернокислый семиводный 0,18 - 0,72; кальций хлористый 0,00009 - 0,000207; натрий углеродистый 0,0009 - 0,0036; глюкоза 0,18 - 0,63; тиамина хлорид 0,00000018 - 0,00000072; рибофлавин 0,00000018 - 0,00000072; пантогенат кальция 0,00000018 - 0,00000072; пиридоксин 0,00000018 - 0,00000072; фолиевая кислота 0,00000018 - 0,00000072; никотинамид 0,00000018 - 0,00000072; изоинозит 0,00000018 - 0,00000072; L-глютамин 0,00008 - 0,0003, натрий хлористый 2,79 - 3,15; холинхлорид 0,00000018 - 0,00000072; фенол-рот 0,00000018 - 0,00000072; сухой ферментативный гидролизат мышечных белков 443,00 - 448,00; сыворотка крови лошадей или северных оленей 85,0 - 95,0; среда Игла - остальное. Кулитивирование проводится в аппарате типа "Гироген", 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, включающий культивирование вируспродуцирующих клеток на ростовой стреле, содержащей среду Игла, ФГМС и сыворотку крови животных, отделение культуральной жидкости с последующим ее концентрированием, отличающийся тем, что культивирование проводят без смены среды при рН 6,8 - 7,4, концентрирование проводят градиентной ультрафильтрацией через мембраны с номинальным пределом 15000 - 16000 Д, а ростовая среда дополнительно содержит натрий фосфорнокислый однозамещенный двухводный, калий хлористый, магний серно-кислый семиводный, кальций хлористый, натрий углекислый, глюкозу, хлорид тиамина, рибофлавин, пантотенат кальция, пиридоксин, фолиевую кислоту, никотинамид, изоинозит, L-глютамин, натрий хлористый, холинхлорид, фенол-рот при следующем соотношении компонентов, г/л:
Натрий фосфорнокислый однозамещенный двухводный 0,27 - 0,81
Калий хлористый 0,045 - 0,135
Магний сернокислый семиводный 0,18 - 0,72
Кальций хлористый 0,00009 - 0,000207
Натрий углекислый 0,0009 - 0,0036
Глюкоза 0,18 - 0,63
Хлорид тиамина 0,00000018 - 0,00000072
Рибофлавин 0,00000018 - 0,00000072
Пантотенат кальция 0,00000018 - 0,00000072
Пиридоксин 0,00000018 - 0,00000072
Фолиевая кислота 0,00000018 - 0,00000072
Никотинамид 0,00000018 - 0,00000072
Изоинозит 0,00000018 - 0,00000072
L-глютамин 0,00008 - 0,0003
Натрий хлористый 2,79 - 3,15
Холинхлорид 0,00000018 - 0,00000072
Фенол-рот 0,00000018 - 0,00000072
ФГМС 443,00 - 448,00
Сыворотка крови животных 85,0 - 95,0
Среда Игла Остальное